[发明专利]微生物发酵生产豆豉溶栓酶的方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学、酶工程、发酵工程、生物化学等领域，具体涉及一种豆豉溶栓酶微生物发酵生产方法。该方法生产的低温豆豉溶栓酶在溶解血栓、激活体内纤溶酶原方面有独特优势，可以广泛应用于溶栓药物和溶栓保健品的生产。

背景技术

豆豉溶栓酶(Nattokinase，简称NK)是一种碱性丝氨酸蛋白酶，无毒性，可口服(李江伟等，中国药学杂志，1999)，易被人体吸收，能直接溶解纤维蛋白，具有强烈溶栓功能(郝征红等，农业工程学报，2008；彭勇等，高技术通讯，2002)，且溶栓作用时间长，作为新一代理想的预防和治疗血栓的生化药物，具有广阔的应用前景(陶琳，氨基酸和生物资源，2004)。早期临床上应用最多的溶栓剂是链激酶、尿激酶等，虽可以促进血液中血纤维蛋白溶酶的形成或可以直接对血栓进行溶解，但都存在不同程度的不足，如半衰期短、抗原性强、副作用较大等，很难成为一种大众药品(卢露，中国调味品，2011)。国内外关于微生物发酵NK研究处于起步阶段，我国主要集中在菌株选育、发酵条件优化、酶学性质，酶分离纯化以及工程菌构建等(陶琳，氨基酸和生物资源，2004；豆孝伟，现代食品科技，2006)。微生物发酵生产NK产业化，规模化生产及作为口服溶栓剂应用还未见报道。微生物发酵生产的NK具有安全性好、不会引起免疫反应、作用迅速、持久、成本低、口服亦有效的优点，弥补了临床溶栓药物的不足。本发明微生物发酵生产NK可以形成一定规模化，生产周期短，成本低，产量高，促使快速治愈脑血栓、肺血栓、急性心肌梗塞等血栓性疾病成为可能。微生物发酵NK具有广阔的开发潜力和应用前景。

发明内容

本发明的目的是提供一种微生物发酵生产NK的方法。该方法主要是微生物经过产物定向驯化后，在26℃～32℃液体发酵生产NK的方法，这种生产方法获得的NK粗酶液活性可以达到180U/ml，如再经过系列分离和纯化，可以得到不同浓度和纯度的酶制剂。当该酶活性为5000U/ml或5000U/mg，口服2000U～4000U每日用量应用于量小鼠实验，22～37天表现出明显的溶栓效果。该酶制剂应用操作简单、方便、快捷、成本低。可以从根本上避免其它溶栓剂应用的弊端。

本发明所述的一种微生物发酵生产NK的方法具体包括以下步骤：

(1)将产生NK的微生物进行6～10次活化，再经过产物定向驯化4～6次，使其在26～32℃环境条件下生长良好；

(2)按常规方法将NK产生菌在26～32℃逐级扩大培养，制备成液体一级种子和二级种子；

(3)将液体一级种子或二级种子，按发酵液体积的3～9％接种量接入液体发酵培养基中，在26～32℃培养72～144h时，即微生物发酵生产NK结束；

(4)将(3)的发酵液在4,000～8,000rpm离心收集液体，收集到的液体即为粗酶液；

(5)根据不同需要和使用对象不同，将(3)得到的粗酶液进一步浓缩、分离纯化，制备成不同活性、纯度和剂型的酶制剂。

本发明中使用的菌种来源于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，初期活化和生长条件按菌种保藏单位提供的说明进行。NK产生菌(例如，CGMCC菌种编号：1.354或1.769)，菌株先活化、定向驯化后，按本发明产酶条件发酵生产NK。产酶驯化后的菌株在4℃环境中可保存2个月，用10～25％甘油制成的菌悬液、在零下80℃条件下可以长期保藏。

具体实施方式

实施例一：

(1)培养基制备

①菌种活化培养基：蛋白胨15.0g，牛肉膏10.0g，NaCl 10.0g，琼脂20.0g，蒸馏水1.0L，pH值7.2～7.4，121℃高压蒸汽灭菌30min。

②菌种产物定向驯化培养基：蛋白胨3.0～7.0g，牛肉膏3.0～7.0g，纤维蛋白10.0～20.0g，NaCl 5.0～15.0g，琼脂20g，蒸馏水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。

③液体种子培养基：胰蛋白胨8.0～12.0g，酵母粉4.0～6.0g，NaCl 8.0～10.0g，自来水1.0L，pH值自然，121℃高压蒸汽灭菌30min。