[发明专利]一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法

权利要求书

1.一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，该方法包含：

步骤1，合成胸腺素α-1基因片段；

步骤2，利用核酸内切酶、连接酶将合成的胸腺素α-1基因片段融合入纯化标签基因和内含肽基因中，获得融合蛋白重组基因，并导入宿主细胞中进行表达；

步骤3，发酵该宿主细胞，使其表达目的融合蛋白从而获得胸腺素融合蛋白；

步骤4，利用所述的纯化标签对步骤3所得的融合蛋白进行纯化，得到纯化后的融合蛋白；

步骤5，利用内含肽的自剪切效应对步骤4所述纯化后的融合蛋白进行裂解，获得胸腺素28肽单体；

步骤6，加入乙酰化试剂对步骤5所述的胸腺素28肽单体的N末端进行乙酰化修饰，获得天然结构的胸腺素α-1；

步骤7，纯化所得的天然结构胸腺素α-1。

2.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，所述的纯化标签包含组氨酸标签、几丁质结合域。

3.如权利要求1或2所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，所述的步骤2中构建的融合蛋白重组基因的排列方式为纯化标签-内含肽-胸腺素或胸腺素-内含肽-纯化标签；所述的纯化标签、内含肽、胸腺素之间的连接方式为直接连接或借助蛋白连接肽连接。

4.如权利要求3所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤2所述的表达包含直接表达以及与其他蛋白融合表达。

5.如权利要求4所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤2所述的宿主细胞，包含原核生物宿主细胞，以及酵母、真菌和其他真核生物宿主细胞。

6.如权利要求5所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤3所述的发酵宿主细胞，是指在发酵罐中接种步骤2所述的宿主细胞，进行发酵培养使其表达目的融合蛋白；所述的步骤3还包含步骤3.1，在发酵培养结束后离心发酵液收集宿主细胞，并用缓冲液将其重悬，超声破碎或者高压匀浆破碎宿主细胞，离心去除不溶物，得到上清液即融合蛋白溶液。

7.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤4所述的对融合蛋白进行纯化，是指将融合蛋白通过亲和层析柱，经缓冲液洗涤去除杂质蛋白，再通过洗脱缓冲液洗脱出目的融合蛋白。

8.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤5所述的融合蛋白裂解获得胸腺素28肽单体，是指在pH值为5-7、温度为4℃-37℃条件下，内含肽发生剪切反应将胸腺素从融合蛋白中剪切下来，然后将所得的蛋白溶液通过亲和层析柱，分离得到胸腺素28肽单体。

9.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤6所述的乙酰化试剂包含乙酰氯、乙酸酐以及羟基琥珀酰亚胺乙酸酯。

10.如权利要求1所述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其特征在于，步骤7所述的纯化所得的天然结构胸腺素α-1，包含利用反相高效液相层析的方法进行纯化。