[发明专利]一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种制备胸腺素多肽的方法，具体涉及一种通过胸腺素α-1与内含肽融合表达、融合蛋白在内含肽介导下断裂释放出胸腺素多肽的方法，即利用内含肽制备胸腺素多肽的方法。

背景技术

胸腺素alpha 1（Thymosin α-1）是由28个氨基酸残基组成的多肽，等电点为4.2，无二级结构无二硫键，唯一的修饰是N-末端乙酰化。胸腺素α-1的氨基酸序列为：N-Ac-Ser-Asp-Ala-Ala-Val-Asp-Thr-Ser-Ser-Glu-Ile-Thr-Thr-Lys-Asp-Leu-Lys-Glu-Lys-Lys-Glu-Val-Val-Glu-Glu-Ala-Glu-Asn-C，它是一种针对T淋巴细胞的免疫增强剂，可以使T细胞成熟和分化，可促使成熟的T细胞、NK细胞分泌各种淋巴因子如白介素-2、γ-干扰素，也可以同时促进白介素-2受体的生成。

胸腺素α-1作为一种免疫增强剂，主要用于治疗免疫缺陷和免疫抑制类疾病。当病人患癌症或感染某些病毒如HIV、HBV或经过放化疗后，其免疫系统往往会被逐渐抑制甚至破坏，而不能发挥对病毒或癌细胞的正常杀伤作用。胸腺素α-1可以恢复T淋巴细胞的功能，促进成熟T细胞的增殖，促进淋巴细胞在病原组织及癌细胞周围的聚集，促进淋巴因子及淋巴因子受体的产生，增强免疫细胞的作用，提高机体对病毒和癌症的抵抗能力。

胸腺素α-1在医疗上的应用主要有以下几个方面：(1)癌症的治疗，已证实其对恶性黑色素瘤、肺癌、白血病、鳞状上皮细胞癌、直结肠癌有效；(2)病毒性肝炎（HBV）的治疗；(3)艾滋病病毒(HIV)的治疗；（4）放疗和化疗病人的免疫系统恢复。胸腺素α-1不仅对多种恶性肿瘤、病毒性肝炎、HIV等常见、多发、高死亡率性的疾病有良好的治疗和缓解作用，还在新生儿免疫、老年人医疗保健方面具有很大的应用潜力。

目前，国内制备胸腺素α-1常用的方法是从动物的胸腺中提取，这种方法的缺点是操作复杂，提取纯度不高，且来源受动物数量限制。国外制备胸腺素α-1常用的方法是化学合成法，该方法的缺点是成本较高且容易造成环境污染。

本发明的目的是利用基因工程技术，根据胸腺素α-1的氨基酸序列，推导并合成其编码核苷酸序列，以融合的方式与纯化标签、内含肽同时表达，利用纯化标签快速纯化出融合蛋白；利用内含肽自切割去除纯化标签获得胸腺素多肽。

发明内容

本发明的目的是提供一种用于制备胸腺素多肽的方法，将胸腺素和内含肽融合表达，克服多肽因其分子量太小难以在常用的原核表达系统如大肠杆菌中表达，以及即使能够表达也因宿主内蛋白酶的水解导致多肽产物不均一的问题，且后期纯化只需改变融合蛋白溶液的pH等条件，即能使内含肽与胸腺素断裂，释放出胸腺素。该方法可以大量制备胸腺素，且成本低、无污染，适宜工业化大生产。

为了达到上述目的，本发明提供了一种利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，该方法包含：步骤1，合成胸腺素α-1基因片段；步骤2，利用核酸内切酶、连接酶将合成的胸腺素α-1基因片段融合入纯化标签基因和内含肽基因中，获得融合蛋白重组基因，并导入宿主细胞中进行表达；步骤3，发酵该宿主细胞，使其表达目的融合蛋白，从而获得包含胸腺素、纯化标签和内含肽的融合蛋白产物；步骤4，利用所述的纯化标签对步骤3所得的融合蛋白产物进行纯化，得到纯化后的融合蛋白；步骤5，利用内含肽的自剪切效应对步骤4所述纯化后的融合蛋白进行裂解，获得胸腺素28肽单体；步骤6，加入乙酰化试剂对步骤5所述的胸腺素28肽单体的N末端进行乙酰化修饰，获得天然结构的胸腺素α-1；步骤7，纯化所得的天然结构胸腺素α-1。

上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，所述的纯化标签包含组氨酸标签His-tag、几丁质结合域CBD等。用基因工程的方法来表达蛋白质，必须经过纯化才能实现最终目的，将目的蛋白和一个亲和纯化短标签进行融合表达，通过亲和纯化标签蛋白来纯化目的蛋白是常用的间接手段，当融合蛋白溶液流经亲和纯化介质时，融合蛋白由于纯化标签的存在会被特异亲和吸附，杂质被洗掉后再洗脱目标蛋白，即达到使目的蛋白纯化的目的。

上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤1所述的胸腺素α-1基因为GeneBank公用数据库公布的人胸腺素α-1 28肽的基因序列。

上述的利用内含肽制备胸腺素多肽的方法，其中，步骤1所述的胸腺素α-1基因是向上海生工、英潍捷基等基因合成公司订制合成的。