[发明专利]用于检测EML4-ALK融合基因突变的引物、探针及检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地涉及融合基因突变的检测试剂盒。

背景技术

肺癌是世界范围内最常见的恶性肿瘤，发病率和死亡率居各癌症之首。每年全世界有超过130万的患者死于肺癌，近一半发生在发展中国家。据2010年我国卫生部的统计，肺癌死亡率为30.83/10万，肺癌已经成为发病率和死亡率第一位的恶性肿瘤。(Orras JM，Fernandez E，Gonzalez JR，et al.Lung cancer mortality in European regions(1955-1997).Ann Oncol，2003，14(1)：159-161；中华人民共和国卫生部，《2010年中国卫生统计》年鉴)。

肺癌从组织病理学上可以分为小细胞癌(SCLC)和非小细胞癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)两大类，其中非小细胞癌约占肺癌总病例的85％。在我国肺癌患者5年的生存率仅为13％，其主要原因是大多数肺癌由于缺乏高灵敏度的基因突变检测和确诊技术，以及与之相匹配科学的治疗方案，从而使患者错失了治疗的最佳时机。

目前化疗仍是肺癌主要治疗手段，然而多数化疗会产生较大的毒副作用，不同患者间的化疗效果会有较大差异。随着肿瘤分子生物学的发展，肺癌的分子靶向治疗因其特异性高，毒副作用低，日益成为临床医生首选治疗方式。EML4-ALK(Echinoderm Microtubule-associated protein-Like 4-Anaplastic Lymphoma Kinase)基因融合突变的发现为NSCLC患者提供了新的治疗靶点。EML4(棘皮动物微管相关蛋白4)与微管形成密切相关；ALK(间变性淋巴瘤激酶)在肿瘤细胞信号转导起着重要的调节作用。EML4主要包含卷曲螺旋结构、疏水EMAP蛋白结构域、色氨酸-天冬氨酸重复结构；EML4和ALK两个基因分别位于人类2号染色体的p21和P23带，相隔约12Mb。这两个基因片段的倒位融合，即inv(2)(p21p23)能够使得组织表达新的EML4-ALK融合蛋白。融合后的EML4启动子位于ALK酪氨酸激酶的上游，从而使融合基因活化，表达EML4-ALK融合蛋白。通过EML4胞外结构形成的二聚体使ALK受体持续磷酸化，进而激活持续下游的细胞信号通路  (Soda M，et al.Nature 2007；448：561-6；Martelli MP，et al.Am.J.Pathol.174(2)：661-70；Koh Y，et al.J Thorac Oncol 2011；6：905-912.)。

以Crizotinib(克里唑蒂尼，Pfizer)为代表的药物是针对EML4-ALK基因融合突变开发的小分子靶向药物，通过抑制ALK酪氨酸激酶区域的活性，阻断其下游异常信号通路，从而抑制肿瘤细胞的生长。临床研究表明Crizotinib对EML4-ALK融合突变患者的有效率可达61％以上，而对野生型的患者几乎没有疗效。因此，检测EML4-ALK融合突变情况是指导Crizotinib类药物用药的前提和基础，在化疗之前通过高灵敏的检测方法检测EML4-ALK融合基因突变对于提高肺癌患者的生存率，延长生存期、避免过度化疗、提高生存质量有着重要意义。

目前，EML4-ALK融合突变的检测方法主要为荧光原位杂交(FISH)法，然而，FISH法检测特异性差，灵敏度较低，检测时间长，而且无法同时检测EML4-ALK融合产生的多种融合变异体。此外，FISH检测需要昂贵的专用仪器设备，试剂成本较高，操作复杂，使临床检测广泛使用受到了限制。FISH检测要求检测样本保存的时间不宜太长，采用保存时间长的样本进行检测会导致假阴性的发生，影响了检测的准确性。因此，FISH检测法无法满足临床医生检测实际应用的需求，临床迫切需要开发一种高灵敏度的可以同时检测EML4-ALK融合基因多种突变的检测方法，以实现采用快速的检测方法对EML4-ALK多种融合突变进行同时检测，从而为临床肺癌个体化治疗方案提供科学参考依据。

针对上述问题，本发明开发一种快速廉价、操作简便的EML4-ALK融合基因突变检测试剂盒及检测方法。本检测方法设计运用一种新型特异引物和探针。本检测方法可以一次同时检测EML4与ALK基因的9种融合突变，检测灵敏度高，检测时间只需90分钟即可完成，同时具备了灵敏度高，特异性好，廉价快速，操作简单等优点，可以满足临床快速检测的实际需求。

发明内容