[发明专利]一种快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒及制备方法无效
| 申请号： | 201210108562.9 | 申请日： | 2012-04-15 |
| 公开（公告）号： | CN102605098A | 公开（公告）日： | 2012-07-25 |
| 发明（设计）人： | 邢秀梅;杨福合;査代明;荣敏;苏伟林;吴琼 | 申请（专利权）人： | 邢秀梅 |
| 主分类号： | C12Q1/68 | 分类号： | C12Q1/68 |
| 代理公司： | 吉林长春新纪元专利代理有限责任公司 22100 | 代理人： | 陈宏伟 |
| 地址： | 130000 吉*** | 国省代码： | 吉林;22 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 一种 快速 检测 产品 多重 pcr 试剂盒 制备 方法 | ||
1. 一种快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，其特征在于包括以下引物：
1）梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
2）马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
3）塔里木马鹿特异mtD-loop:
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
4）驯鹿线粒体特异mt16S rDNA:
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’。
2. 权利要求1所述的快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒，其特征在于包括DNA提取液、鹿源性多重PCR反应液和猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液和阴性标准品：
所述的DNA提取液：
（1）低盐缓冲液（pH 7.6-7.8）：12-13份Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），32-35份 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），7-8份MgCl2，4-5份NaCl,余份为水；
（2）细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
（3）蛋白酶K：2份蛋白酶K，100份水；
所述的鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物DF、引物CCF、引物CYF、引物DR、引物RTF、引物RTR、Taq酶；
具体引物序列为：
1）梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
2）马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
3）塔里木马鹿特异mtD-loop:
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
4）驯鹿线粒体特异mt16S rDNA:
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’ ；
猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物SSF、引物SSR、引物OAF、引物OAR、引物GGF、引物GGR、引物BTF、引物BTR、Taq酶；
具体引物序列为：
1）猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
2）牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
3）羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
4）鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
阴性标准品：为无菌双蒸水。
3. 权利要求2所述快速检测鹿产品的多重PCR试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
1）鹿源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
设计梅花鹿，赤鹿，马鹿，塔里木马鹿和驯鹿的特异性引物；其中包括一个共同的下游引物（DR），一个上游引物（DF）和两个物种特异性上游引物（赤鹿CCF，塔里木马鹿CYF）；
①梅花鹿、马鹿、塔里木马鹿、赤鹿和驯鹿特异mtD-loop：
DF（上游）：5’-CAAAGCACGTGATATAACCTTATG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
②马鹿特异mtD-loop：
CCF（上游）：5’-CATGTATAACAGTACATGAGTTAGCG-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
③塔里木马鹿特异mtD-loop：
CYF（上游）：5’-CTCAACATCCATTTTACATCTTACATTA-3’
DR（下游）：5’-CATGGTAATTAAGCTCGTGATCTA-3’
④驯鹿线粒体特异mt16S rDNA：
RTF（上游）：5’-GGAGTAATCCAGGTCGGTTTCTATC-3’
RTR（下游）：5’-TAGGGCGGGATATGTTTGTGTATC-3’
（2）所述的鹿源性多重PCR反应液：
ddH2O、10×PCR Buffer、dNTPs、引物DF、引物CCF、引物CYF、引物DR、引物RTF、引物RTR、Taq酶：
2）所述的DNA提取液：
（1）低盐缓冲液（pH 7.6-7.8）：12-13份Tris碱（三羟甲基氨基甲烷），32-35份 Na2EDTA（乙二胺四乙酸二钠），7-8份MgCl2，4-5份NaCl,余份为水；
（2）细胞裂解液：4-6份 SDS十二烷基硫酸钠，4-6份Triton X-100(聚乙二醇对异辛基苯基醚)，1000份低盐缓冲液；
（3）蛋白酶K：2份蛋白酶K，100份水；
3）猪、牛、羊、鸡源性多重PCR反应液
（1）引物设计：
猪、羊、鸡的特异性引物：
①猪特异mt12S rRNA-tRNA-Val：
SSF（上游）：5’-CTACATAAGAATATCCACCACA-3’
SSR（下游）：5’-ACATTGTGGGATCTTCTAGGT-3’
②牛特异tRNA-Val-16S rRNA：
BTF（上游）：5’-GTGCTTGGATAAATCAAGATATAGC-3’
BTR（下游）：5’-CTTGGTTGTTTAGTCGAGAGGG-3’
③羊特异tRNA-Lys-ATP8：
OAF（上游） 5’- TTAAAGACTGAGAGCATGATA-3’
OAR（下游）：5’- ATGAAAGAGGCAAATAGATTTTCG-3’
④鸡特异12S rRNA：
GGF（上游）：5’- TGAGAACTACGAGCACAAAC-3’
GGR（下游）：5’-GGGCTATTGAGCTCACTGTT-3’
（2）PCR反应液：
Taq酶 5U/μl，10×PCR buffer，dNTPs 100 μM，引物OAF、OAR 50 μM，引物SSF、SSR、GGF、GGR、BTF、BTR均为20 μM；
4）阴性标准品：为无菌双蒸水。
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