[发明专利]立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

权利要求书

1.一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：

(1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；

式(I)中，(R)m表示m个R取代基，R为H、羟基或卤素，m为1或2；

(2)转化反应结束后，取转化液添加FeCl₃显色剂溶液进行显色反应5～30min，转化液与FeCl₃显色剂溶液体积之比为1∶10～30；反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶或含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若现淡黄色，表明待测样品中含有与底物的立体构型相反的α-羟酸脱氢酶；所述FeCl₃显色剂溶液组成如下：FeCl₃·6H₂O 1～2mmol/L，二甲基亚砜200～500ml/L，冰醋酸10～30ml/L，溶剂为水。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中呈现蓝绿色时，所述方法进一步包括步骤(3)和(4)：

(3)另取呈现蓝绿色的待测样品溶于pH为6～9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(1)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应； 

(4)转化反应结束后，取转化液按照步骤(2)方法进行显色反应，显色反应结束后，若呈现颜色均一的蓝绿色，则表明待测样品中含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若呈现淡黄色，表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述α-羟酸为苯基乳酸或对羟基苯基乳酸。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述pH 6～9的缓冲液为pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌体，所述方法如下：

(A)取微生物菌体均匀分散于pH6.0～9.0的磷酸盐缓冲液中，制成OD₆₀₀值为5～10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液10μL添加200～300μL的FeCl3显色剂溶液进行反应5～30min，反应结束后，呈现蓝绿色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，呈淡黄色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品；

(B)另取脱氢酶阳性样品两份，溶于pH7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应，转化反应结束后，取转化液10μL添加200～300μL的FeCl₃显色剂溶液进行反应5～30min，显色反应结束后，若仅有一份呈现蓝绿色，则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈蓝绿色样品中添加的手性α-羟酸的立体构型一致，若两 份转化液均呈现蓝绿色则表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性；

所述FeCl₃显色剂溶液组成如下：FeCl₃·6H₂O 2mmol/L，二甲基亚砜400ml/L，冰醋酸20ml/L，溶剂为水。