[发明专利]立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。

(二)背景技术

立体选择性α-羟酸脱氢酶为一类特殊的氧化还原酶，能立体选择性催化外消旋α-羟羧酸类化合物中的一种异构体生成相应的α-酮酸，反应液中留下另外一种异构体(见下式)，由于产物中光学活性的α-羟酸与酮酸的性质差异较大，易于分离。利用该酶可以用于生产手性的α-羟酸和酮酸，具有良好的开发应用前景。

利用α-羟酸脱氢酶拆分外消旋α-羟酸生产手性的α-羟酸，拓宽光学活性化合物的生产方法，具有重要的意义。近年来已有一些研究把目光放在了利用微生物或者酶法来拆分外消旋α-羟酸及其相关衍生物。

苯基乳酸，即2-羟基3-苯基丙酸，是一种重要的化学合成前体，广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。它的第2个碳原子为手性碳原子，故有两种对映体(见下式)

3-苯基乳酸的两个对映体之间除空间结构方向相反以外，其它物理性质如：熔点、沸点、相对密度以及在非手性溶剂中的溶解度都完全相同。而由于构成生物体的有机物大都是有旋光活性的，两个对映体不仅具有不同的光学性质，而且还具有不同的生物活性，因此，单一对映体的3-苯基乳酸在对生物体的作用及其在医药、化工等方面的应用存在较大的差异。R-苯基乳酸可用于合成降血糖制剂Englitaznoe、新型驱肠虫药PA1002A，并对人体内类固醇的水平有一定的调节作用；S-苯基乳酸可用于合成高血压蛋白酶原肾素抑制剂、非蛋白氨基酸statine的4种立体异构体、抗艾滋病病毒(HIV)制剂等药品；在抑菌效果上，R构型明显强于S构型。Yamamoto等研究表明R-苯基乳酸能提高人体肝内3α-轻基类固醇脱氢酶DD4的活性，1mmol/L R-苯基乳酸能使活力提高2倍(Yamamotoeta.l，J Biochem，2000，128：121)。3α-羟基类固醇脱氢酶分布于人体的组织中，能合成和降解类固醇，所以R-苯基乳酸对人体内的类固醇的水平有一定的调节作用。因此，采用简便快速的方法合成手性3-苯基乳酸具有非常重要的意义。

立体选择性羟酸脱氢酶能够催化羟酸产生相应的酮酸，可用于拆分外消旋的羟酸化合物生产手性羟酸，具有广阔的应用前景，可以用这种羟酸脱氢酶将苯基乳酸进行拆分，得到苯基乳酸的单体，具有很多用途。

据不完全统计，目前国际市场上光学活性的α-羟酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为国际热点的重大化工产品；学活性的α-羟酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。

目前，立体选择性α-羟酸脱氢酶生物催化剂的筛选还是利用传统的GC或HPLC法去对海量的微生物或酶逐一检测，费时又费力，造成工作效率不高；另一方面，随着蛋白质定向进化技术的不断发展，为了更快得到突变子，能够建立对这些催化剂进行快速有效表征的方法就显得尤为迫切。迄今为止，未见有立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选模型的报道。

(三)发明内容

本发明目的是提供一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。

本发明采用的技术方案是：

一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：

(1)取待测含α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH 6～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；所述待测样品为已知具有α-羟酸脱氢酶活性的样品，可以是酶液，也可以是菌体；

对于未知活性的酶活菌体样品，筛选其是否具有α-羟酸脱氢酶活性的方法如下：取待筛选的样品(酶液或菌体)均匀分散于pH＝6.0～9.0的磷酸缓冲液中，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加0.2～3mL的2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，继续加入3～10mL的NaOH溶液，显红棕色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品。

式(I)中，(R)m表示m个R取代基，R为H、羟基或卤素(优选为H或羟基)，m为1或2；