[发明专利]一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法

权利要求书

1.一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征是包括如下步骤：

(1)原料处理：将原料单环刺螠洗净后，匀浆，制成匀浆液；

(2)酶解：向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，在43℃-47℃水浴条件下酶解4-6h，酶解液煮沸灭酶后，5000r-8000r/min离心10min-15min，得上清液；

(3)超滤：将所述上清液通过相对分子质量1万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量1万以下和相对分子质量1万以上的两种组分的液体；

(4)糖胺聚糖的制备

①除蛋白质：将所述相对分子质量1万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的1/3-1/4，先用HCl水溶液调pH至2.0，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7.0，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为3％-5％，离心除去蛋白质沉淀；

②醇沉、洗涤：将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为70％-80％，于4℃条件下静置20-28小时，5000r-8000r/min离心10min-15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2-4次，得粗提糖胺聚糖；

③阴离子交换柱层析：将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为1％-3％，加到阴离子交换柱中，先用pH＝5.0-5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液浓缩至洗脱液体积的1/2-1/4、透析、再浓缩至透析后液体积的1/3-1/4；

④凝胶过滤层析：将步骤③获得的浓缩液上样于SephadexG-100凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；

(5)抗菌肽制备：将所述相对分子量1万以下组分的液体浓缩至该液体体积的1/2-1/4，上样于SephadexG-100凝胶过滤柱，用0.2mol/L pH＝7.0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/2-1/3，浓缩液上样于SephadexG-25凝胶过滤柱，0.2mol/L pH＝7.0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。

2.根据权利要求1所述的一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述步骤(2)中枯草杆菌中性蛋白酶的添加量为所述匀浆液质量的0.8％-1％。

3.根据权利要求1所述的一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，其特征在于所述阴离子交换柱的填料为DEAE-52纤维素或Q-Sepharose Fast Flow。