[发明专利]一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物工程领域，涉及糖胺聚糖和抗菌肽的制备，尤其是涉及一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法。

背景技术

单环刺螠俗名海肠、海肠子，属于螠虫动物门、螠纲、无管螠目、刺螠科。体粗大，长约100-300mm，宽约25-27mm，体表满布大小不等的粒状突起，吻圆锥形；腹刚毛1对，粗大；肛门周围有一圈9-13条褐色尾刚毛，是我国北方沿海泥沙岸潮间带下区及潮下带浅水区底栖生物的常见种。目前对单环刺螠研究集中在形态结构、胚胎发育、生活史、人工育苗技术、营养成分分析及血栓溶解酶等，对于单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的开发应用尚未见报道。

糖胺聚糖是海洋生物中含量较丰富的物质，是由重复的二糖单位构成的长链多糖，具有明显的抗凝血、抗肿瘤、抗病毒和提高机体免疫力的作用；抗菌肽是动物免疫防御系统在诱导条件下产生的一类对抗外源性病原体致病作用的防御性肽类活性物质，广泛存在于植物和动物体内，分子质量一般在4ku左右，抗菌肽是生物体内的内源性抗生素，是生物体先天性免疫体系的重要组成部分。

发明内容

本发明的目的是提供一种以单环刺螠为原材料，同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法。

本发明的技术方案概述如下：

一种同时制备单环刺螠糖胺聚糖和抗菌肽的方法，包括如下步骤：

(1)原料处理：将原料单环刺螠洗净后，匀浆，制成匀浆液；

(2)酶解：向所述匀浆液中加入枯草杆菌中性蛋白酶，在43℃-47℃水浴条件下酶解4-6h，酶解液煮沸灭酶后，5000r-8000r/min离心10min-15min，得上清液；

(3)超滤：将所述上清液通过相对分子质量1万的中空纤维滤膜超滤分离，得到相对分子质量1万以下和相对分子质量1万以上的两种组分的液体；

(4)糖胺聚糖的制备

①除蛋白质：将所述相对分子质量1万以上的组分的液体浓缩至该液体体积的1/3-1/4，先用HCl水溶液调pH至2.0，离心除去沉淀，上清液用NaOH水溶液调pH至7.0，离心除去沉淀，上清液加入三氯乙酸使三氯乙酸的最终质量浓度为3％-5％，离心除去蛋白质沉淀；

②醇沉、洗涤：将步骤①获得的上清液在搅拌下加入乙醇，使乙醇的体积浓度为70％-80％，于4℃条件下静置20-28小时，5000r-8000r/min离心10min-15min，移去上清液，沉淀依次用丙酮和无水乙醇洗涤2-4次，得粗提糖胺聚糖；

③阴离子交换柱层析：将粗提糖胺聚糖溶于蒸馏水中，使其质量浓度为1％-3％，加到阴离子交换柱中，先用pH＝5.0-5.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液洗脱，再用0-2mol/L梯度的NaCl水溶液洗脱，洗脱液浓缩至洗脱液体积的1/2-1/4、透析、再浓缩至透析后液体积的1/3-1/4；

④凝胶过滤层析：将步骤③获得的浓缩液上样于SephadexG-100凝胶过滤柱，进一步分离纯化，收集的流出液浓缩至流出液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得高纯糖胺聚糖；

(5)抗菌肽制备：将所述相对分子量1万以下组分的液体浓缩至该液体体积的1/2-1/4，上样于SephadexG-100凝胶过滤柱，用0.2mol/L pH＝7.0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/2-1/3，浓缩液上样于SephadexG-25凝胶过滤柱，0.2mol/L pH＝7.0乙酸钠水溶液洗脱，洗脱液浓缩至该洗脱液体积的1/4-1/6，浓缩液冷冻干燥得抗菌肽纯品。

最好的是步骤(2)中枯草杆菌中性蛋白酶的添加量是匀浆液质量的0.8％-1％。

阴离子交换柱的填料优选DEAE-52纤维素或Q-Sepharose Fast Flow。

本发明的优点和积极效果是：

1.本发明的方法反应条件温和、制备过程绿色环保节能，一种原料同时制备两种活性物质，产品附加值高；

2.本发明的方法采用单环刺螠为原料，制备的糖胺聚糖和抗菌肽纯度高；

3.本方法在制备糖胺聚糖和抗菌肽的同时还可大量回收蛋白质，有利于单环刺螠的综合利用，所制备的糖胺聚糖具有明显的抗凝血(AT、PT和APTT三项指标均显著高于空白对照组)、清除自由基(对于羟自由基和超氧阴离子自由基的清除能力显著高于空白对照组)的效果，制备的抗菌肽对于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、嗜水气单胞菌等具有明显的抑菌活性；所得的糖胺聚糖和抗菌肽还可为海珍动物养殖业提供优良的免疫增强剂和新型抗菌药物。

附图说明

图1为单环刺螠糖胺聚糖对白兔TT实验的影响。