[发明专利]一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

权利要求书

1.一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：

(1)取被测含有α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；

式(I)中，n为1或2，(R)m表示m个R取代基，R为H或卤素，m为1或2；

(2)取转化液添加2，4-二硝基苯肼的溶液进行显色反应20～90min，反应结束后，若有黄亮色絮状沉淀生成，且加入NaOH溶液后，黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶或含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若显淡绿色，表明待测样品含有的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与底物的立体选择性相反。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中转化液呈现红棕色时，所述方法进一步包括步骤(3)和(4)：

(3)另取转化液显红棕色的待测样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加立体构型与步骤(1)相反的手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；

(4)取转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行显色反应20～90min，反应结束后，若有黄亮色絮状沉淀生成，且加入NaOH溶液后，黄亮色的絮状沉淀变成颜色均一的红棕色溶液，则表明待测样品中含有的α-羟酸脱氢酶没有立体选择性；若显淡绿色，表明待测样品中含有与步骤(1)底物的立体构型一致的α-羟酸脱氢酶。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述扁桃酸及其衍生物为下列之一：(1)扁桃酸，(2)2-氟扁桃酸、(3)2-氯扁桃酸、(4)3-氯扁桃酸、(5)4-氟扁桃酸、(6)4-氯扁桃酸、(7)4-溴扁桃酸、(8)2，4-二氟扁桃酸、(9)3，5-二氟扁桃酸，(10)苯基乳酸。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述pH为5～9的缓冲液为pH 7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述2，4-二硝基苯肼溶液为浓度为0.5～6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为0.01～5mM。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于所述NaOH溶液浓度为0.1～5M。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于所述待测样品为微生物菌体，所述方法如下：

(A)取待筛选的微生物菌体均匀分散于pH＝6.0～9.0的磷酸缓冲液中，制成OD600值为5～10的菌悬液，添加结构如式(I)所示α-羟酸的外消旋体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，取转化液添加0.2～3mL的2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min，反应结束后继续加入3～10mL的NaOH溶液，显红棕色的为α-羟酸脱氢酶阳性样品，显淡绿色的为α-羟酸脱氢酶阴性样品；

(B)另取α-羟酸脱氢酶阳性样品两份，溶于pH 7.5～8.0的磷酸二氢钠-磷酸氢二钠缓冲液中，各自添加手性的结构如式(I)所示的R-或S-α-羟酸单体进行对照，所添加的R-或S-α-羟酸终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行反应，分别取转化液添加2，4-二硝基苯肼溶液进行反应20～90min后，继续加入NaOH溶液进行显色，若仅有一份转化液显红棕色，表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶的光学选择性与呈红棕色样品中添加的手性α-羟酸的立体构型一致，两份转化液均显红棕色表明样品中所含的α-羟酸脱氢酶没有光学选择性；

上述步骤(A)和(B)中，所述2，4-二硝基苯肼溶液为浓度为0.5～6mM的盐酸或硫酸溶液，其中2，4-二硝基苯肼的浓度为0.01～5mM；所述NaOH溶液浓度为0.1～5M。