[发明专利]一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法

说明书

(一)技术领域

本发明涉及一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。

(二)背景技术

立体选择性α-羟酸脱氢酶为一类特殊的氧化还原酶，能立体选择性催化外消旋α-羟羧酸类化合物中的一种异构体生成相应的α-酮酸，反应液中留下另外一种异构体(见下式)，由于产物中光学活性的α-羟酸与酮酸的性质差异较大，易于分离。利用该酶可以用于生产手性的α-羟酸和酮酸，具有良好的开发应用前景。

利用α-羟酸脱氢酶拆分外消旋α-羟酸生产手性的α-羟酸，拓宽光学活性化合物的生产方法，具有重要的意义。近年来已有一些研究把目光放在了利用微生物或者酶法来拆分外消旋α-羟酸及其相关衍生物。

光学活性的α-羟酸是指手性碳上带有羟基同时带有羧基的一类化合物，是重要的手性“砌块”，可用于不对称合成大量生物活性分子。在这类化合物中，光学纯扁桃酸在商业角度上被认为是最重要的代表。扁桃酸又称a-羟基苯乙酸、苯乙醇酸、苦杏仁酸，其R型和S型的结构式如下：

光学活性的扁桃酸及其衍生物是一种极为重要的药物中间体：如R-(-)-扁桃酸广泛地应用于多种药物的合成，如头孢菌素，青霉素，抗肿瘤制剂，抗肥胖药物、光学纯的氨基酸、血管紧张肽转化酶抑制剂、辅酶A、氯吡格雷等。S-(+)-扁桃酸则是合成S-(+)-奥昔布宁的前体原料，S-(+)-奥昔布宁临床用于治疗尿急、尿频、尿失禁。研究表明，单一构型的扁桃酸所合成的药物与外消旋的扁桃酸或其衍生物合成的药物相比，不仅药效更高，更关键的是副作用下降了，因此在许多药物合成方面应用必须要求是单一型化合物；光学活性的扁桃酸还可以用作手性溶剂，用于多种不对称合成反应；光学活性的扁桃酸由于具有很好的生物分解性，是目前最受瞩目的酸性光学拆分剂，可使多数外消旋胺类和氨基酸类以非对映体异构盐形成进行光学拆分，如治咳药甲吗南的中间体八氢异喳琳衍生物可由R-扁桃酸拆分。扁桃酸其苯环上不同位置上不同的卤素取代基的衍生物同样具有优良的医药用途，如苯环上单氟或多氟取代的扁桃酸衍生物(如邻氟扁桃酸、间氟扁桃酸、2，4-二氟扁桃酸等)是一类控制体重的苯乙醇胺类药物的重要中间体，3，5-二氟扁桃酸的酰胺衍生物是一种很好的C-端氨基醇二肽Aβ抑制剂。氯代物方面邻间对位置具有广泛的运用，特别是(R)-邻氯扁桃酸是全球销售额第二药物氯吡格雷合成的关键手性砌块，2009年全球销售额高达99亿美元，单药销售收入排名全球第2位，是目前最畅销的药物之一。

光学活性扁桃酸侧链不同长度的衍生物也非常的有价值，苯基乳酸是一些重要的化学合成物前体，并广泛应用于医药、化工、生物合成等领域。近几年来，它作为一种新型的抑菌剂又受到食品行业的广泛关注。(R)-2-羟基-4-苯基丁酸是抗高血压首选药-普利类药物合成的重要原料。

据不完全统计，目前国际市场上光学活性的α-羟酸需求约以年均10％以上的速度增长，已成为国际热点的重大化工产品；学活性的α-羟酸作为一种高附加值的物质，其应用非常广泛、且市场需求量大，其制备越来越受到重视。

目前已报道的用于拆分α-羟酸的含有立体选择性α-羟酸脱氢酶的微生物菌株主要有Alcaligenes bronchisepticus，Pseudomonas polycolor，Brevibacterium.sp，Pseudomonas sp，Alcaligenes faecalis，Pseudomonas putida等，这些已报道的菌株均存在活性低，反应时间长，转化率低等问题，难以工业化。

虽然利用生物法拆分扁桃酸及其相关的衍生物取得了一定的成果，但立体选择性α-羟酸脱氢酶生物催化剂的筛选还是利用传统的GC或HPLC法去对海量的微生物或酶逐一检测，费时又费力，造成工作效率不高；另一方面，随着蛋白质定向进化技术的不断发展，为了更快得到突变子，能够建立对这些催化剂进行快速有效表征的方法就显得尤为迫切。迄今为止，未见有立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选模型的报道。

(三)发明内容

本发明目的即是提供一种立体选择性α-羟酸脱氢酶的筛选方法。

本发明采用的技术方案是：

立体选择α-羟酸脱氢酶的筛选方法，所述方法包括：

(1)取被测含有α-羟酸脱氢酶的样品溶于pH为5～9的缓冲液中，添加结构如式(I)所示的α-羟酸手性单体作为底物至底物终浓度为1～100mM，于20～50℃水浴中进行转化反应；所述待测样品为已知具有α-羟酸脱氢酶活性的样品，可以是酶液，也可以是菌体；