[发明专利]聚精胺阳离子及其构建方法和纳米颗粒的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种聚阳离子、构建方法和含有聚阳离子的纳米颗粒的制备方法，特别涉及一种用于输送核酸药物(DNA和RNA)的可降解酰胺类聚精胺阳离子及其构建方法和纳米颗粒的制备方法。

背景技术

核酸药物(DNA和RNA)可通过调控与疾病相关基因的表达或者沉默而达到治疗疾病的目的。目前，核酸药物成为新一代治疗药物的主要障碍是体内输送技术的缺位。在已报道的核酸药物输送载体中，合成的非病毒载体相比病毒载体而言，具有一系列的优点：无免疫原性、无病毒变异、基因担载量大、制备方法简单、生产成本低等，但也存在着生物相容性差、无组织或细胞靶向性、体内循环时间短等缺点。尽管如此，合成的非病毒载体仍然成为核酸药物输送革命性突破的第一候选。综合分析，用于核酸药物输送的非病毒载体系统需要克服以下生物学屏障：(1)凝聚核酸形成纳米颗粒，以避免吞噬降解；(2)选择性地吸附到病变细胞；(3)促进核酸从内涵体里逃逸；(4)释放核酸进入细胞质；(5)载体自身完成无毒化的代谢。

经过对现有技术的检索发现，Jin等人申请一项题为“Polycationic gene carriers formed of endogenous amino group-bearing monomers”的PCT专利(WO2009/100645A1)，该专利中采用人体内源性专职凝聚基因的小分子单体精胺分别与1，4-丁二醇二氯甲酸酯、1，4-丁二酰氯和乙二醛等三个连接剂，缩合得到分别含有氨酯键、酰胺键和亚胺键的聚精胺阳离子，这些聚阳离子表现出良好的核酸输送能力，而且，聚合物通过生物响应性降解能够回归到精胺内源性单体的初始状态，具体的特征是良好的生物相容性，但该技术的缺陷在于：含有氨酯键、酰胺键的聚阳离子降解速率比较慢，导致核酸物质无法及时从内涵体里逃逸，影响核酸输送效率；含有亚胺键的聚阳离子降解速率比较快，但是载体的不稳定性致使其输送的核酸物质尚未到达胞质，便从细胞外释放出来，转染效率大大降低。

发明内容

本发明的第一目的在于提供一种聚精胺阳离子，以解决现有技术中的含有氨酯键、酰胺键的聚阳离子在输送核酸物质时，降解速率比较慢，导致核酸物质无法及时从内涵体里逃逸，影响核酸输送效率；而含有亚胺键的聚阳离子在输送核酸物质时，降解速率比较快，但是载体的不稳定性致使其输送的核酸物质尚未到达胞质，便从细胞外释放出来，导致转染效率大大降低的技术性问题。

本发明的第二目的在于提供一种聚精胺阳离子的构建方法。

本发明的第三目的在于提供一种包括聚精胺阳离子的纳米颗粒的制备方法。

本发明目的通过以下技术方案实现：

一种聚精胺阳离子，其结构式为：

其中，n为10～1000。

一种聚精胺阳离子的构建方法，包括以下步骤：

(1)将羧基活化的咪唑-4，5-二甲酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液在-10℃～10℃条件下缓慢滴加到精胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液中，同时，加入催化剂；

(2)滴加完毕后，在10～30℃条件下搅拌进行聚合反应24～48小时，将反应溶液分离，纯化，即得聚精胺阳离子。

优选地，在所述步骤(1)中，将所述羧基活化的咪唑-4，5-二甲酸的N，N-二甲基甲酰胺溶液在0℃条件下缓慢滴加到精胺的N，N-二甲基甲酰胺溶液中。

优选地，所述催化剂选自三氟乙酸或吡啶。

优选地，所述步骤(2)中的分离，纯化步骤进一步包括：将所述反应溶液置于透析袋中透析，抽滤，预冻，冻干除去水分。

优选地，所述透析袋的截留分子量为7000，透析的时间为12～48小时。

优选地，所述聚精胺阳离子在pH 7.4的磷酸盐缓冲液中重均分子量的降解半衰期为48～60小时，所述聚精胺阳离子在pH 5.8的磷酸盐缓冲液中重均分子量的降解半衰期为4～12小时。

一种包括聚精胺阳离子的纳米颗粒的制备方法，包括以下步骤：

(1)将聚精胺阳离子溶解于超纯水或无RNase酶水配制成浓度为1～3mg/ml的聚精胺阳离子溶液，将核酸药物溶解于超纯水或无RNase酶水配制成浓度为0.5～1mg/ml的核酸药物溶液；

(2)将所述聚精胺阳离子溶液快速加入核酸药物溶液中，均匀混合；

(3)将混合溶液于室温下孵育20～30分钟，即得包括聚精胺阳离子的纳米颗粒。

优选地，所述核酸药物为DNA或RNA。

优选地，所述核酸药物为DNA疫苗、siRNA或microRNA。