[发明专利]用于体内递送多核苷酸的多缀合物

说明书

本申请是申请日为2007年8月17日、发明名称为“用于体内递送多核苷酸的多缀合物”的中国专利申请200780029802.3(国际申请号PCT/US2007/076202)的分案申请。

相关申请的交叉参考

本申请要求2006年8月18日提交的美国临时申请号60/822,833和2007年5月3日提及的美国临时申请号60/915,868的优先权。

发明背景

多核苷酸和其他膜不透性化合物向活细胞的递送受到细胞的复杂的膜系统的高度限制。用于反义和基因治疗的药物是相对较大的亲水聚合物并且通常也是带大量负电荷的。这两种物理特征阻碍了它们经细胞膜的直接扩散。为此原因，多核苷酸递送的主要障碍是多核苷酸向细胞内部的递送。已经开发了多种转染试剂在体外将多核苷酸递送到细胞。然而，在体外有效的转染试剂的毒性、血清相互作用和弱的寻靶作用使得多核苷酸的体内递送复杂化。在体外良好运行的转染试剂、阳离子聚合物和脂类通常去稳定化细胞膜并形成大的颗粒。转染试剂的阳离子电荷促进了核酸结合以及细胞结合。膜的去稳定化促进了膜不透性多核苷酸经细胞膜的递送。这些性质使得转染试剂在体内无效或有毒性。阳离子电荷导致与血清组分的相互作用，其引起多核苷酸-转染试剂相互作用的去稳定化和弱的生物利用度和寻靶作用。阳离子电荷也可以导致体内毒性。在体外有效的转染试剂的膜活性通常导致体内毒性。

对于体内递送，转染复合体(与待递送的核酸结合的转染试剂)应该是小的，直径小于100nm，并且优选小于50nm。甚至小于20nm或小于10nm的更小的复合体将是更有效的。大于100nm的转染复合体在体内基本上不能接近除了血管细胞之外的细胞。体外复合体也是带正电荷的。该正电荷对于复合体与细胞的附着和膜融合、去稳定化或破坏是必须的。体内转染复合体上的阳离子电荷导致不利的血清相互作用并且因此导致弱的生物利用度。接近中性或负电荷的复合体将具有更好的体内分布和寻靶能力。然而，体外转染复合体通过电荷-电荷(静电)相互作用与核酸结合。带负电荷的聚合物和脂类不与带负电荷的核酸相互作用。此外，这些静电复合体当暴露于生理盐浓度或血清组分时倾向于聚集或瓦解。最后，在体外有效的转染复合体通常在体内是有毒的。用于转染的聚合物和脂类破坏或去稳定化细胞膜。用核酸递送平衡该活性在体外比在体内更容易达到。

尽管一些研究小组已经在改善体内基因向细胞的递送方面取得了不断的进步，但是仍然需要将多核苷酸与递送剂一起有效递送到靶细胞而没有与体内施用转染试剂相关的毒性的制剂。本发明使用生物学不稳定的缀合物递送系统提供了将多核苷酸递送到细胞并释放的组合物和方法。

发明概述

在优选的实施方案中，本发明描述了用于在体内将多核苷酸递送到细胞的组合物，其包含与多核苷酸可逆地缀合的可逆掩蔽的膜活性聚合物。聚合物通过一个或多个第一种可逆共价连接连接到一种或多种掩蔽剂并且通过一个或多个第二种可逆共价连接进一步连接到一种或多种多核苷酸。第一种和第二种可逆共价连接可以包含在相同或相似的条件下被切割的可逆键或者它们可以在不同的条件下被切割，即它们可以包含正交(orthogonal)可逆键。对哺乳动物施用可药用载体或稀释剂中的多核苷酸-聚合物缀合物。

在优选实施方案中，公开了膜活性聚合物，其包含：聚乙烯醚随机共聚物。可以从两种、三种或多种不同的单体合成聚乙烯醚共聚物。单体可以选自：受保护的氨基乙烯醚，如含有苯二甲酰亚氨基的乙烯醚、丁基乙烯醚、十二烷基乙烯醚、十八烷基乙烯醚。优选的聚乙烯醚随机共聚物包含三种单体：含有胺的单体、丁基乙烯醚和十八烷基乙烯醚。

在优选实施方案中，膜活性聚合物的一种或多种生物物理学特征通过掩蔽剂可逆地屏蔽或修饰。掩蔽剂可以选自位阻稳定剂、寻靶基团(targeting groups)和电荷修饰剂。掩蔽剂可以通过抑制聚合物与血清组分或非靶细胞的非特异性相互作用而改善聚合物-多核苷酸的生物分布或寻靶作用。掩蔽剂也可以减少聚合物或聚合物-多核苷酸缀合物的聚集。含有寻靶基团的掩蔽剂可以通过将缀合物系统靶向细胞表面受体而增强细胞特异性寻靶作用或细胞内化。在聚合物缀合到多核苷酸之前或之后，可以将掩蔽剂缀合到膜活性聚合物。

在优选实施方案中，使用所述的缀合物系统可以被递送到细胞的多核苷酸可以选自：DNA、RNA、封闭性多核苷酸、反义寡核苷酸、质粒、表达载体、寡核苷酸、siRNA、微RNA、mRNA、shRNA和核酶。