[发明专利]一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法

权利要求书

1.一种利用蛹虫草的液体发酵生产虫草酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10～15％的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20～25℃，摇床培养24～72h，得种子液；

(2)将步骤(1)制得种子液按5～15％的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20～25℃的条件下，液体发酵培养20～30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.5～2.5mg/mL，然后继续培养96～144h，分离，得到蛹虫草菌丝体；

(3)从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内虫草酸，即得虫草酸。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的活化培养条件为：摇床转速100～160r/min，温度20～25℃，暗培养活化24～72h。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中的种子发酵培养基，每升组分如下：

3g葡萄糖、2.5g酵母粉上清液、0.1g MgSO₄、0.03g CaCl₂、0.1g KH₂PO₄、0.1gK₂HPO₄，2～5颗直径3～6mm的玻璃珠。

4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下：

3g乳糖、2g糖蜜、2g豆粕粉、3g蛋白胨，0.2g MgSO₄、0.03g CaCl₂、0.3g KH₂PO₄、0.3g K₂HPO₄。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为1.0～2.5mg/mL。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为1.8～2.0mg/mL；最优选的，所述步骤(2)中，扩张蛋白的浓度为1.5mg/mL。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(2)中的扩张蛋白溶液按照如下方法制备：

将蚕豆或黄瓜种子经0.05～0.15wt％ HgCl₂消毒4～6min，流水冲洗5～7h，栽入湿蛭石，25～28℃暗培养4～6天；剪取幼苗上胚轴或根系4～5cm，置-20℃预冷1～2h，加预冷至0～4℃的匀浆缓冲液匀浆后，用孔径60～80μm的尼龙网过滤，滤渣经匀浆缓冲液洗涤，然后将滤渣加入匀浆缓冲液中，室温静置1～3h，得静置液；向静置液中加入提取液，0～4℃下提取24～30h，过滤，按0.3～0.5g/mL的添加量向滤液中缓慢添加(NH₄)₂SO₄，添加(NH₄)₂SO₄过程中不断搅拌，防止(NH₄)₂SO₄局部过饱和，然后静置24～30h，4℃条件下25000g离心5～10min，沉淀用酸性缓冲液复溶，4℃下分子量3000Da的透析袋透析，透析液经20000g离心5～10min，取上清液即为制备的扩张蛋白溶液。

8.如权利要求7所述的方法，其特征在于，所述匀浆缓冲液组分为：25mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，3mmol/L Na₂S₂O₅，1mmol/L乙二胺四乙酸，0.1wt％ Triton X-100，pH7.0；所述提取液组分为：25mmol/L 4-羟乙基哌嗪乙磺酸，1.0mmol/L乙二胺四乙酸，3mmol/L Na₂S₂O₅，0.5mol/L NaGl，pH 6.8；所述酸性缓冲液配制是：将2.05g醋酸钠溶于水中，用冰醋酸调节pH至4.0，水定容至1L。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(2)中所述的分离是在4℃ 12000r/min条件下离心分离5～10min。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中提取蛹虫草虫草酸活性成分的方法，步骤如下：

将步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体65℃烘干1～3h，研成粉末，取0.1g蛹虫草菌丝体粉末加20mL体积浓度为50％的乙醇溶液，以500W的功率微波处理1min，然后12000r/min离心5min，取上清液，沉淀中加入20mL体积浓度为50％的乙醇溶液，按前述步骤微波处理并离心，合并上清液，制得虫草酸。