[发明专利]一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法，属于生物发酵工程技术领域。

背景技术

蛹虫草Cordyceps militaris是虫菌结合的药用真菌，是子囊菌亚门Ascomycota、肉座菌目Hypocreales、麦角菌科Clavicipitaceae、虫草属Cordyceps的模式种，又名北冬虫夏草、北蛹虫草等，为现代珍稀中草药，其所含的药用成分和多种药效可与传统名药——冬虫夏草相媲美，其中的虫草酸是主要的生理活性物质，有抗自由基、抗氧化的性质。而且，虫草酸含量的高低被作为衡量虫草质量的主要标准之一，一般认为虫草酸含量高的虫草的药用价值高。试验测定，冬虫夏草含虫草酸成分约为7％，而蛹虫草中的虫草酸活性成分含量要明显高于冬虫夏草，使其应用价值得到人们的广泛关注。药理学研究表明，虫草酸具有促进人体新陈代谢，改善人体微循环系统，明显降低血脂，抑制细菌，增强对疾病的抵抗力等作用，以及镇咳、祛痰、平喘的功效。虫草的增强免疫功可使肝脏的解毒作用增强，抗肝组织纤维化，抗脂质过氧化，能够有效保护肝细胞，同时可预防和治疗脑血栓、脑出血、心肌梗塞、长期衰竭等。

由于对蛹虫草虫草酸等活性成分的需求增长迅速，野生蛹虫草资源被疯狂采摘而日益稀少昂贵，通过化学合成其活性成分的途径工艺复杂且产量极低，因此其广泛应用受到药源资源的严重制约。研究发现，通过液体发酵生产与从蛹虫草子实体、菌丝体中直接提取得到的虫草酸等活性成分在生化结构、生理作用上基本是相同的，而且具有培养周期短、生产流程易控制、活性物质易于提取等优点，虫草酸等活性物质的提取含量及效率都要远高于利用人工栽培虫草进行生产和提取。但是目前的蛹虫草及虫草酸等活性成分的生产仍是以传统的固体栽培为主，液体培养研究和应用由于发展时间短，许多发酵技术和工艺仍不成熟，整体产量和发酵水平较低，限制了其工业化生产的发展。

扩张蛋白是在植物细胞壁中发现的一类新蛋白种类。研究表明，扩张蛋白几乎参与了植物的整个发育过程：除具有增大细胞的功能外，扩张蛋白在细胞生长、种子萌发、根毛形成、根系生长、叶原基形成、叶子生长发育、果实成熟、器官脱离，以及花粉管生长方面起着重要的作用。在拟南芥、番茄、草莓、棉花、水稻和玉米等多种植物中均已发现扩张蛋白，被认为其普遍存在于各种双子叶和单子叶植物的细胞壁中。试验表明扩张蛋白是一类细胞壁酶蛋白，能够通过打断细胞壁多聚物之间的氢键诱导酸依赖的细胞壁延展和压力松弛，进而可能还是在植物生长过程中起生理调控和细胞壁延伸过程中的一个重要调控因子。然而，关于扩张蛋白的作用机制目前仍未有明确定论，将扩张蛋白应用于食药用菌蛹虫草的液体发酵进行虫草酸等次生代谢产物的生产，国内外目前均未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术的不足，提供一种利用扩张蛋白进行蛹虫草液体发酵生产虫草酸的方法。本发明技术方案如下：

一种利用蛹虫草的液体发酵生产虫草酸的方法，包括如下步骤：

(1)将蛹虫草菌种接种到PD液体发酵培养基中，进行活化培养，然后按体积百分数10～15％的接种量转接到种子发酵培养基中，进行种子培养，种子培养条件为：温度20～25℃，摇床培养24～72h，得种子液；

(2)将步骤(1)制得种子液按5～15％的体积比接种于液体发酵培养基中，在温度20～25℃的条件下，液体发酵培养20～30h，然后加入扩张蛋白溶液，使扩张蛋白的浓度为0.5～2.5mg/mL，然后继续培养96～144h，分离，得到蛹虫草菌丝体；

(3)从步骤(2)制得的蛹虫草菌丝体中提取蛹虫草胞内虫草酸，即得虫草酸。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PD液体发酵培养基，每升组分如下：

马铃薯200g、葡萄糖20g，蒸馏水定容至1000mL。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的活化培养条件为：摇床转速100～160r/min，温度20～25℃，暗培养活化24～72h。

根据本发明优选的，所述步骤(1)中的种子发酵培养基，每升组分如下：

3g葡萄糖、2.5g酵母粉上清液、0.1g MgSO₄、0.03g CaCl₂、0.1g KH₂PO₄、0.1gK₂HPO₄，2～5颗直径3～6mm的玻璃珠。经种子发酵培养基培养后，菌球数量可提高60％以上、菌球直径缩小40％以上，菌丝松散均匀。

根据本发明优选的，所述步骤(2)中的液体发酵培养基，每升组分如下：