[发明专利]对目标DNA序列进行特异性信号放大和检测的方法

权利要求书

1.一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的方法，所述待测体系中不存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列，该方法包括如下步骤：

1)制备单脱碱基双标记荧光探针，该探针为5’-OH末端的单链DNA，其脱碱基位置位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列完全匹配互补，或者仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置与目标序列错配；

2)将步骤1)制备的探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37℃进行实时荧光测定：所述探针与待测体系中的目标序列特异性结合，经内切酶IV和Lamdba外切酶切割后发出荧光，释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，从而实现对目标序列的信号放大和检测。

2.一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的方法，所述待测体系中可能存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列，该方法包括如下步骤：

1)制备单脱碱基双标记荧光探针，该探针为5’-OH末端的单链DNA，其脱碱基位置位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置错配，而与干扰序列在脱碱基位置3’下游第一和第三两个碱基位置错配；

2)将步骤1)制备的探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37℃进行实时荧光测定：所述探针与待测体系中的目标序列特异性结合，经内切酶IV和Lamdba外切酶切割后发出荧光，释放出的目标序列继续与另一个探针特异性结合，重复上述过程，荧光信号快速上升；而所述探针与待测体系中的干扰序列特异性结合后，荧光信号上升受到抑制；从而实现对目标序列的信号放大和检测。

3.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，在所述探针上，荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在探针的中部或3’末端。

4.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤1)通过化学合成法制备所述单脱碱基双标记荧光探针；或者，先制备含有单一尿嘧啶脱氧核苷酸位点的双标记荧光探针，然后用尿嘧啶-DNA-糖基化酶对其进行处理，切除尿嘧啶碱基，得到单脱碱基双标记荧光探针。

5.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述探针长度为20-30核苷酸残基。

6.如权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述荧光基团和猝灭基团是下列基团对之一：FAM和TAMRA，FAM和BHQ1，或者TET和BHQ2。

7.一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的试剂盒，所述待测体系中不存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列，该试剂盒包括：单脱碱基双标记荧光探针、内切酶IV和Lambda外切酶，其中所述探针为5’-OH末端的单链DNA，其脱碱基位置位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处，荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列完全匹配互补，或者仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置与目标序列错配。

8.一种对待测体系中的DNA目标序列进行特异性信号放大和检测的试剂盒，所述待测体系中可能存在与目标序列仅有一个碱基差异的干扰序列；该试剂盒包括：单脱碱基双标记荧光探针、内切酶IV和Lambda外切酶，其中所述探针为5’-OH末端的单链DNA，其脱碱基位置位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处，荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游，二者之间相隔三个核苷酸残基以上；除脱碱基位置外，该探针与DNA目标序列仅在脱碱基位置3’下游第一个碱基位置错配，而与干扰序列在脱碱基位置3’下游第一和第三两个碱基位置错配。

9.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，所述探针长度为20-30核苷酸残基。

10.如权利要求7或8所述的试剂盒，其特征在于，在所述探针上，荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在探针的中部或3’末端；所述荧光基团和猝灭基团是下列基团对之一：FAM和TAMRA，FAM和BHQ1，或者TET和BHQ2。