[发明专利]对目标DNA序列进行特异性信号放大和检测的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA序列检测领域，包括核酸信号放大、单核苷酸多态性(SNP)分型以及低丰度点突变检测等技术领域。具体来说，涉及利用内切酶IV/Lambda外切酶复合酶体系与单脱碱基探针的一种放大体系，实现温和条件下高灵敏度、高选择性、快速地检测目标DNA序列。

背景技术

核酸信号放大技术近几年取得了迅速的发展，分别建立了以限制性内切酶、核酸外切酶III和DNA酶为基础的信号放大方法。这类技术的检测工具都是DNA探针，理论上有希望应用于生命体系中进行原位、活体检测。另一方面，放大过程一般为恒温，操作较为简便。因而，核酸信号放大技术较PCR有一定的优势。但是，目前发展的一些信号放大方法，灵敏度不够理想，比PCR低4-5个数量级，而特异性方面表现也较为一般：对于单碱基错配的区分并不明显。所以，这些信号放大方法的主要应用依旧局限于偶联其他检测体系，为这些检测体系放大检测信号。

实际上，信号放大的优势并不仅仅在于提高信号相对于底物的比值，还可以用于放大信号差值：如果DNA探针能够有效区分完全匹配与单碱基错配，那么信号放大技术则可以有效的将这个差异放大，从而被仪器检测到。对于SNP分型和低丰度突变检测来说，最关键的环节就是区分完全匹配与单碱基错配的信号。所以，特异性高、普适性好的信号放大技术能够方便的应用于这两个领域，而且与已有检测方法相比，信号放大技术有操作简单，容易设计等优点。

因此，迫切需要开发具有高选择性的信号放大体系，将信号放大技术的优点应用于SNP分型以及低丰度突变的检测。

发明内容

本发明的目的是建立一种可以在温和条件下(例如37℃的生理温度条件下)选择性放大目标DNA序列信号的放大体系，从而实现高选择性、高灵敏度、易操作的DNA检测。

内切酶IV是一种脱嘌呤/嘧啶(AP)核酸内切酶，水解DNA上的完整AP位点(脱碱基位置)，切割5’端与AP位点相连的第一个磷酸二酯键，产生3’-OH和5’-P末端，其最适工作温度为37℃。Lamdba外切酶催化双链DNA分子从5’-P末端进行逐步的水解，释放出5’-单核苷酸，但不能降解5’-OH末端。根据这两种酶的上述特性，本发明利用单脱碱基探针的区分作用，结合内切酶IV和Lamdba外切酶的切割作用，采用如下技术方案，对DNA目标序列进行信号放大和检测。

设计单脱碱基的双标记荧光探针，探针为5’-OH末端的单链DNA，脱碱基位置(AP位点)位于探针5’末端下游第3-6位核苷酸残基处；荧光基团和猝灭基团中的一个标记在脱碱基位置下游六个核苷酸残基以内，另一个标记在上一个基团的下游(可以在探针链的中部或3’末端)，二者之间相隔三个核苷酸残基以上。将该探针与待测体系混合，然后加入内切酶IV和Lamdba外切酶，在37℃的检测温度下，如果待测体系中存在能与所述探针特异性结合的DNA目标序列，则探针与该目标序列所形成的双链DNA中的脱碱基空位被内切酶IV识别并切割，结合于目标序列上的探针被内切酶IV切割为3-6 nt的短链和剩余的长链，3-6 nt的短链会从目标序列上解离下来，与目标序列保持结合的剩余长链的5’-P末端则引发Lamdba外切酶的进一步切割，当荧光基团或猝灭基团标记的核苷酸残基被切割后，荧光集团与猝灭基团远离，荧光共振能量转移(FRET)被破坏，从而发出荧光信号，而探针剩余片段的核苷酸残基被Lamdba外切酶逐个水解，释放出的目标序列依旧完好，可以继续与另一个探针特异性结合，再次引发上述反应；重复上述过程，实现目标序列的信号放大和检测，所检测到的荧光强度越高表明待测体系中目标序列的含量越高。

进一步的，本发明在研究过程中还发现了一个重要现象：

参见图1，除AP位点外，当DNA目标序列与探针有一个碱基错配，且该错配位于探针AP位点的3’下游第一个碱基位置时(定义该位置为1号位点，定义探针AP位点3’下游第二个碱基位置为2号位点，3号位点、4号位点等等依此类推)，所述信号放大过程得到加速，即：荧光上升速率大于DNA目标序列与探针完全匹配的情况。另一方面，当DNA目标序列与探针在3号位点错配时，信号放大过程得到较大程度抑制；如果目标DNA序列与探针在1、3号位置同时错配时，信号放大过程受抑制程度更高，荧光上升非常缓慢。

根据上述现象的启发，探针具体设计时有如下原则：