[发明专利]胶乳增强免疫比浊法测定人甲胎蛋白含量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种利用胶乳增强免疫比浊方法测定人体体液(包括血清和羊水)中甲胎蛋白含量的试剂盒，属于医学免疫体外诊断领域。

背景技术

甲胎蛋白(α-fetoprotein，或AFP)，分子量为68kD，是一条多肽链糖蛋白，由590个氨基酸组成，含糖量4％。甲胎蛋白的基因位于常染色体的4q11～q22区域，基因约有20kb长，含15个外显子，14个内含子，与血清白蛋白、维生素D结合蛋白为同一家族，与白蛋白有50％的氨基酸相同，等电点4.7～4.8，电泳时位于白蛋白与α-球蛋白之间。

在胎儿发育过程中，肝脏是合成甲胎蛋白的主要场所，其次是卵黄囊，来自内胚层的胃肠道粘膜也可以合成少量的甲胎蛋白。人体胚胎的第6周开始合成，12～14周合成达到高峰，血清的浓度为1～3mg/mL，以后逐渐降低，出生时血清浓度约为19～100μg/mL，一年后，血清浓度降至正常水平，约为5.8ng/mL。

正常人血清中甲胎蛋白含量极少，低于20ng/ml。但在原发性肝癌、肝炎、肝硬化及卵黄囊肿瘤等患者中，甲胎蛋白会有不同程度的升高，有的甚至升高上千倍以上；孕期母体的血清或羊水中甲胎蛋白也高于正常人，因受胎儿血中高浓度甲胎蛋白波动影响，不同孕期甲胎蛋白浓度有规律的变化。

甲胎蛋白作为一种肿瘤标志物，其含量变化与多种疾病有关，包括肝细胞癌、卵黄囊肿瘤、非内胚层胃肠道癌、生殖细胞癌等。甲胎蛋白在临床诊断上主要用于以下三方面：

1.肝细胞癌：早期诊断，高危人群的筛查、分期及预后的诊断、疗效检测；

2.卵黄囊肿瘤：早期诊断，且与治疗效果相关，其上升与下降可反映内胚窦瘤的生长状况、病情进展与缓解；

3.产科检查：筛查神经管缺陷、非整倍体的实验室标志物。

甲胎蛋白的检测方法较多，传统的包括酶联免疫吸附实验(ELISA)、放射免疫分析(RIA)、时间分辨荧光(TRFIA)、化学发光(CLIA)免疫分析方法等。其中，化学发光方法的灵敏度和线性都较高，检测范围可以达到1～1000ng/mL，但试剂成本相对较高且配套的大型仪器比较昂贵。酶联免疫法应用较普遍，但该方法为非均相免疫检测系统，其优点在于：通过使用过量的固定化抗体和标记抗体，实现高灵敏度和较高水平的精确性；缺点在于：测定过程中需要进行洗涤分离步骤，耗时长，缺少单位测试运行时间；自动化程度不高，批间差和重复性相对较大；针对不同的步骤需要配备多种专门的设备，一定程度上增加了产品的成本。

近年来，由于不断增长的检测数量，临床上迫切需要一种更为简便、快速的方法取代传统的检测方法。胶乳增强免疫比浊法检测甲胎蛋白是基于均相免疫分析测定系统的一种方法，在普通的生化分析仪上即可完成反应全程，可实现快速、高高通量样本的检测。由于甲胎蛋白在正常人体内含量相对较低，利用胶乳增强免疫比浊均相免疫分析测定时，一般采用较高的样本量来弥补此法灵敏度低的缺陷；但灵敏度得以提高的同时又将面临高的样本量引入的干扰物质，如类风湿因子、补体等，造成的非特异性反应。

为克服高样本引入的非特异性反应，现在市售的胶乳比浊法检测甲胎蛋白试剂盒通常采取用多克隆抗体IgG酶切得到的F(ab)’₂包被胶乳颗粒，在一定程度上降低了非特异性反应。但F(ab)’₂需要由IgG经酶切纯化后方可使用，酶切制备工艺中会损失一部分抗体且对抗体活性也有一定程度影响，更重要的是试剂制备过程进一步复杂对控制试剂批间差设置了不可逾越的障碍。试剂批间差的主要影响因素由原来单纯的交联工艺控制，扩大到酶切纯化抗体工艺控制。该法不仅推高了试剂成本，批间差较大，并且开瓶后稳定性较差，从而限制了此类试剂在临床上的推广。

IgY类抗体是一类来源禽类，如鸡、鸭、鹅等体内产生的主要抗体形式。研究证实，来源于禽类的抗体(IgY)与哺乳动物产生的抗体(主要为IgG)相差较大。IgY不能激活人体补体系统，不与类风湿因子或Fc受体相结合，能有效避免在免疫检测过程中产生假性结果，保证了试剂的较高特异性。同时，在遗传上与人类进化关系差别较大的禽类产生的抗体具有比哺乳动物多克隆抗体更高亲和性，此类抗体效价高用量相对降低，试剂成本方面也有一定优势。

综上，若将IgY抗体应用于胶乳增强免疫比浊法，代替F(ab)’₂来检测人体甲胎蛋白的含量，不仅保证了试剂的特异性也简化了生产工艺，便于控制试剂批间差，还可以有效降低成本，临床推广具有显著的优势。