[发明专利]山羊乳腺上皮细胞的建系方法

权利要求书

1.一种山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，包括以下步骤：

(一)山羊乳腺上皮细胞的分离

(1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的DPBS溶液洗涤一遍；

(2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成1mm³小块，用移液器吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持1cm²左右；

(3)37℃、5％CO₂、饱和湿度下将培养皿倒扣干涸培养6～12h，期间勿翻动；

(4)上述(3)倒扣干涸培养结束后，添加乳腺上皮细胞培养液，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下将培养皿正置培养；

(5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4～6ml，自接种组织块72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8～10ml；以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10％FBS+1％ITS+10ng/ml EGF；

(二)山羊乳腺上皮细胞的纯化

(6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80～90％汇合时，吸弃培养基，用DPBS洗涤2遍；

(7)加入乳腺上皮细胞消化液于37℃、5％CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细胞消化液的成分包括0.02％EDTA和0.25％Trypsin；

(8)期间不断观察，当大部分成纤维细胞变圆且即将脱落时，迅速晃动培养皿用已有的消化液带下即将脱落的细胞，并用移液器吸尽；

(9)迅速再次加入上述消化液于37℃、5％CO₂、饱和湿度下消化；

(10)期间不断观察，当大部分上皮样细胞即将脱落时，加入乳腺上皮细胞终止培养液终止消化；传代比例始终保持1∶2；所述乳腺上皮细胞终止液成分为：DMEM/F12+10％FBS；

(11)重复(7)～(11)步骤，直至成纤维细胞去除干净；

(三)山羊乳腺上皮细胞的传代培养

(12)纯化后的乳腺上皮细胞铺满皿底80～90％时，加入所述乳腺上皮细胞消化液进行消化，消化时间以大部分上皮细胞变圆脱落为止，用所述乳腺上皮细胞终止液终止消化并离心、弃上清，传代比例始终保持1∶2；

(四)山羊乳腺上皮细胞冻存

(13)纯化后的乳腺上皮细胞长至90％，使用所述乳腺上皮细胞消化液消化，至大部分细胞变圆即将脱落时，用所述乳腺上皮细胞终止液终止消化并离心、弃上清；

(14)使用提前37℃预热的乳腺上皮细胞冻存液重悬(15)中离心、弃上清后的细胞沉淀，每6cm皿冻存2管，每管分取0.2～0.5ml，冻存管放入含有新鲜异丙醇的冻存盒，-80℃过夜，第二天早上转入液氮灌。

2.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，步骤(1)中所述乳房组织为妊娠60天～90天的山羊乳房组织。

3.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，步骤(1)中所述含有青霉素和链霉素的DPBS溶液中的青霉素浓度为400IU/ml，链霉素浓度为400μg/ml。

4.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，步骤(3)中，所述的干涸培养时间为10h。

5.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，步骤(4)中，在所述干涸培养结束后添加2ml乳腺上皮细胞培养液。

6.根据权利要求1所述的山羊乳腺上皮细胞的建系方法，其特征在于，步骤(5)中所述自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至5ml，72h后添加至8ml。