[发明专利]山羊乳腺上皮细胞的建系方法

说明书

[技术领域]

本发明涉及动物体细胞体外培养、建系方法，尤其是涉及一种建立山羊乳腺上皮细胞系的方法，包括山羊乳腺上皮细胞系的分离、纯化、传代培养、冻存。

[背景技术]

体外培养的乳腺细胞具有重要的研究价值，首先，通过体外培养的乳腺上皮细胞在细胞水平开展研究模拟动物乳腺发育、泌乳等事件，为揭示其调控机制提供一定的实验依据；其次，此前有报道用商业化小鼠乳腺癌细胞(C-127)、人乳腺细胞癌细胞(MCF-7)检测乳腺特异表达载体构建的合理性和有效性，但是在小鼠、人乳腺癌细胞中的检测结果能否代表乳腺特异表达载体在大动物乳腺中的表达情况还存在一定的质疑，而原代培养的大动物乳腺上皮细胞保持了体内特异性的功能和信号转导途径，相比之下，牛、羊等乳腺上皮细胞可以更加真实、准确的反应乳腺特异表达载体在大家畜乳腺中的表达水平；再者，如果体外培养的乳腺上皮细胞可以保持良好的分化状态、且有足够的传代培养能力，可以将检测有效表达外源蛋白的转基因乳腺上皮细胞作为核移植供体细胞生产转基因克隆动物，这样能大大提高制作乳腺生物反应器的成功率。上述动物乳腺上皮细胞的重要应用对体外培养的乳腺上皮细胞有很高的要求，如乳腺细胞的纯度、体外培养时体内功能保真性、体外传代寿命。

乳腺细胞是高度分化的细胞，需要摸索体外培养的合适条件，已建立的乳腺上皮细胞系的物种有人、小鼠、奶牛、绵羊、山羊等，但是在目前已成功培养的大动物乳腺上皮细胞系，在使用过程中出现了形态上的分化或没有腺上皮细胞典型的特点，能够用于开展实验的并不多见，这与大动物原代乳腺上皮细胞制备过程较为繁琐、乳腺细胞体外分化培养难度大有关。其一，大动物乳腺上胚细胞系在原代培养时多数采用了泌乳期中后期为组织来源，使用组织块法或酶消化法在提前预铺有鼠尾胶原等细胞外基质的细胞培养皿上进行原代培养，但也有在细胞外基质条件下进行原代培养的。关于建立乳腺上破细胞系的组织块乳腺来源时期、原代培养方法、是否需要预铺胶原胶原等细胞外基质都没有统一的说法；其二，在培养体系上，不同人建立的相同物种乳腺上皮细胞系在培养基中使用的外源生长因子组合不尽相同，总体上都是成分较为复杂，使用了多种昂贵外源激素(如催乳素、孕酮、氢化可的松、雌二醇等)、细胞因子(表皮生长因子、胰岛素样生长因子-1、胰岛素等)，使得开展乳腺上皮细胞培养成本较高。总之，上述多种因素为广泛开展乳腺上皮细胞的相关研究带来了诸多不便。本发明从取材来源、分离方法、传代培养方法、培养体系等方面进行改进，提供了一种新型的、低成本的、高效的培养山羊乳腺上皮细胞方法，为开展山羊乳腺发育、泌乳调控机制、乳腺生物反应器等研究提供大量极易获得的材料。

[发明内容]

本发明要解决的技术问题是提供一种山羊乳腺上皮细胞的建系方法。

为了解决上述技术问题，本发明采用的技术方案是：一种山羊乳腺上皮细胞的建系方法，包括以下步骤：

(一)山羊乳腺上皮细胞的分离

(1)选用已经与妊娠期山羊相分离的乳房组织，经杀菌和清洗处理后放入含有青霉素和链霉素的DPBS溶液中进行洗涤，然后去除脂肪和结缔组织，留下白色颗粒状腺泡组织块，再放入含青霉素和链霉素的DPBS溶液中洗涤2遍，最后转入不含青霉素和链霉素的DPBS溶液洗涤一遍；

(2)将适量组织块放入离心管，滴加数滴血清湿润，将其剪成1mm³小块，用移液器吸出适量的剪碎后组织均匀涂布于培养皿，间距保持1cm²左右；

(3)37℃、5％CO₂、饱和湿度下倒扣干涸培养6～12h，期间勿翻动；

(4)上述(3)倒扣干涸培养结束后，添加2ml乳腺上皮细胞培养液，于37℃、5％CO₂、饱和湿度下正置培养；

(5)自接种组织块24h后补加乳腺上皮细胞培养液至4～6ml，自接种组织块72h后补加乳腺上皮细胞培养液至8～10ml；以后每隔3d观察一次，注意观察细胞爬出情况及污染情况，并酌情换液；所述乳腺上皮细胞培养液的成分为：DMEM/F12+10％FBS+1％ITS+10ng/ml EGF；

(二)山羊乳腺上皮细胞的纯化

(6)当培养皿中贴壁混合细胞达到80～90％汇合时，吸取培养基，DPBS洗涤2遍；

(7)加入乳腺上皮细胞消化液于37℃、5％CO2、饱和湿度下消化；所述乳腺上皮细胞消化液的成分包括0.02％EDTA和0.25％Trypsin；