[发明专利]睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途

权利要求书

1.一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶，其特征是：

Xho I 起始密码子

GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT

                                  终止密码子 BamH I。

2.一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的用途是：

利用睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶降解环境中的睾丸酮、胆固醇及其衍生物。

3.如权利要求1所述的一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶的制取方法是：

a.以C.testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11.5.1对所测定序列进行开放阅读框分析，为一个完整的开放阅读框，基因全长765bp，通过所测定序列做BLAST分析，确定该基因为3，17β-HSD；

b.通过XboI和BamHI进行双酶切，使3，17β-HSD基因连接在大肠杆菌高表达载体pET-15b的Xho I和BamH I 酶切位点上构建重组质粒p3/17β-HSD，转化表达宿主菌BL21,进行IPTG诱导表达；此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29.5KD；

MTNRLQGKVALVTGGASGVGLEVVKLLLGEGAKVAFSDINEAAGQQLAAELGERSMFVRHDVSSEADWTLVMAAVQRRLGTLNVLVNNAGILLPGDMETGRLEDFSRLLKINTESVFIGCQQGIAAMKETGGSIINMASVSSWLPIEQYAGYSASKAAVSALTRAAALSCRKQGYAIRVNSIHPDGIYTPMMQASLPKGVSKEMVLHDPKLNRAGRAYMPERIAQLVLFLASDESSVMSGSELHADNSILGMGL；

c.对大肠杆菌中3，17β-HSD的表达产物进行了western blotting验证；确定构建的重组表达宿主菌可进行高表达3，17β-HSD；

d.对大肠杆菌中3，17β-HSD的表达产物做生物活性测定；以睾丸酮和胆固醇为底物，以高效液相色谱法进行残留量测定，该酶对睾丸酮和胆固醇的生物活性都很强；

e.采用Ni-柱亲和层析，对3，17β-HSD的表达产物进行了纯化，获得了高纯度的3，17β-HSD。