[发明专利]睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途

说明书

技术领域

本发明属于应用环境微生物技术领域，涉及一种利用分子生物学技术，从睾丸酮丛毛单胞菌中克隆到一个新的基因，在降解环境污染物睾丸酮、胆固醇上的应用。

背景技术

，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）是睾丸酮丛毛单胞菌（C.testosteroni）中降解类固醇等物质的系列酶中的关键酶，阿根廷科学家利用Northern的分子生物学手段研究发现，此酶受部分类固醇激素诱导（Identification of a novel steroid inducible gene associated with The  βhsd locus of Comamonas testosteroni，José Luis Pruneda-Paz and so on，Argentina），然而对于其基因结构及功能未进行研究，国内未见报道。尤其是在C.testosteroni以及假单胞杆菌中未见报道。

发明内容

本发明的目的是：提供一种睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶及其用途，3，17β-HSD基因是首次从C.testosteroni中克隆得到的，并对它进行了序列测定与分析。同时在大肠杆菌中进行了该基因的高表达以及生物功能的确定。此酶是由254个氨基酸残基组成的，SDS-PAGE显示分子量为29.5KD。研究发现3，17β-HSD对睾丸酮、胆固醇有高效降解作用（降解率达90%以上），是一种可作用于多种类固醇的酶，该酶的研究、开发和应用在检测和降解环境中睾丸酮、胆固醇及其衍生物具有极大的价值。

本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）是：

 Xho I 起始密码子

GCTCGAGATGACAAATCGTTTGCAGGGTAAGGTGGCGCTGGTCACTGGTGGTGCCAGCGGTGTGGGTCTTGAGGTGGTGAAGCTGCTTCTTGGCGAAGGCGCCAAGGTCGCATTCAGCGATATCAATGAAGCGGCGGGGCAGCAACTGGCGGCTGAACTGGGCGAACGCTCCATGTTTGTCCGCCATGACGTGAGCAGCGAGGCGGACTGGACGCTTGTGATGGCGGCGGTGCAGCGGCGTCTGGGCACGCTCAATGTGCTGGTCAACAATGCCGGCATCCTGCTGCCTGGTGACATGGAAACAGGGCGTCTGGAGGATTTCAGCCGCCTGCTCAAGATCAACACCGAGTCAGTCTTCATTGGTTGCCAGCAGGGCATTGCGGCGATGAAGGAGACAGGAGGCTCCATCATCAATATGGCCTCGGTATCGAGCTGGCTGCCCATAGAGCAATACGCCGGCTATAGCGCCAGCAAGGCCGCCGTGTCGGCACTGACCCGCGCCGCTGCACTGAGCTGTCGAAAGCAAGGCTATGCGATTCGCGTCAATTCCATTCATCCCGATGGCATCTATACGCCCATGATGCAGGCTTCGCTGCCAAAGGGCGTGAGCAAGGAAATGGTCTTGCATGACCCCAAGCTCAACCGTGCCGGCCGCGCCTATATGCCCGAGCGTATCGCGCAGCTGGTGTTGTTCCTGGCCAGCGACGAGTCCAGTGTCATGAGCGGTAGCGAGCTGCATGCAGATAACTCGATTCTGGGCATGGGGCTATAGGGATCCTTAT

                                  终止密码子 BamH I

本发明的睾丸酮丛毛单胞菌3，17β-羟基类固醇脱氢酶（3，17β-HSD）制取方法是：

1.以C.testosteroni基因组为模板，通过PCR技术扩增了末端含有Xho I和BamH I酶切位点的DNA片段，对其进行了亚克隆及测序，用软件Vector nti 11.5.1对所测定序列进行开放阅读框分析，为一个完整的开放阅读框，基因全长765bp(如下所示)，通过所测定序列做BLAST分析，确定该基因为3，17β-HSD。