[发明专利]鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法

说明书

技术领域

本发明涉及RT-PCR检测技术，具体地说，涉及鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法。

背景技术

新城疫(Newcastle disease，NDV)是目前严重危害养禽养殖业的主要传染病之一，其病原为新城疫病毒(Newcastle disease virus，NDV)。根据国际病毒分类委员会(International Committeeon Taxonomy of Viruses，ICTV)关于病毒的最新分类报告，NDV归属于副黏病毒科、副黏病毒亚科的禽腮腺炎病毒属(Avulavirus)。虽然目前NDV只有一个血清型，却具有明显的基因多样性，根据F基因序列分析至少可以划分为10个基因型。系统的分子流行病学调查结果显示基因VII型是当前世界范围内最主要的流行毒株，近期亚洲、欧洲、非洲、中东以及南美洲的ND爆发大多与该基因型毒株有关。目前常用的NDV疫苗株是LaSota株，属于基因II型毒株，与基因VII型流行毒株存在较大的差别。

传统的新城疫病毒实验室检测方法为病毒分离鉴定，需要将临床可疑病料处理后接种合适的载体(如鸡胚、鸡胚成纤维细胞等)进行病毒分离，通过血凝(HA)和血凝抑制(HI)试验对分离到的可疑病毒进行鉴定，一般还要通过最小致死量致死鸡胚的平均时间(MDT)测定，1日龄雏鸡脑内接种致病指数(ICPI)的测定和6周龄雏鸡静脉接种致病指数(IVPI)测定确定分离病毒的毒力强弱，因此相对比较费时费力。

聚合酶链式反应(PCR)是一种体外扩增特异性基因片段的技术，在疾病的检测方面有着广阔的应用前景，近年已越来越多的被广泛应用。利用反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)能够选择性地将鸡新城疫病毒基因组的一个特异性短片段放大10万倍以上，极大地增强了检测的敏感性。但我国对新城疫的控制主要是利用疫苗进行免疫防控，利用常规RT-PCR不能够区分NDV疫苗株和野毒株，给临床诊断带来一定的困难。

系统研究显示，目前我国流行的NDV主要流行株(基因VII型)与常用疫苗株(基因II型)存在明显基因差异。国内基因VII型野毒株F和HN基因核苷酸同源率均在93％以上，但与LaSota疫苗株的同源率均仅80％左右。这种基因差异为建立RT-PCR方法鉴别常用疫苗株与主要流行野毒株提供了可能。

发明内容

本发明的目的在于克服现有检测手段的不足，提供一种采用反转录聚合酶链式反应(RT-PCR)技术对鸡新城疫病毒疫苗株和流行株感染进行快速鉴别检测的方法。

为了实现本发明目的，本发明的一种鉴定鸡新城疫病毒流行株与疫苗株的RT-PCR法，包括以下步骤：

1)临床样品经预处理后，提取样本总RNA。

2)反转录(RT)得到样本cDNA。

3)以样本cDNA为模板，使用以下引物组合进行PCR扩增。

上游引物P1：5’-GTCGTGCTCAGTGATGTG-3’；

上游引物P2：5’-GCTCCGCCTACTCCGTCAG-3’；

下游引物P3：5’-TTGTTACCTCAATGTGCC-3’；以及

下游引物P4：5’-GCAGGAACTTGACTATGA-3’。

4)分析PCR扩增产物，结果判定。即对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，根据电泳结果确定样品中能否扩增出各目的条带。如果无目的条带则为鸡新城疫病毒检测阴性；如果扩增出通用目的条带(646bp)和基因II型目的条带(339bp)则为基因II型鸡新城疫病毒检测阳性；如果扩增通用目的条带(646bp)和基因VII型目的条带(452bp)则为基因VII型鸡新城疫病毒检测阳性；如果同时扩增出通用目的条带、基因II型和基因VII型目的条带则为基因II型和基因VII型鸡新城疫病毒检测阳性；如果仅扩增出通用条带则为非基因II型和基因VII型的新城疫病毒检测阳性。