[发明专利]耐有机溶剂蛋白酶的突变体

说明书

技术领域

本发明属于基因工程研究领域，涉及耐有机溶剂蛋白酶的突变体，具体的是通过基因工程改造得到的在有机溶剂中具有高稳定性的蛋白酶。

背景技术

生物催化技术广泛用于制药、精细化工等合成领域，然而通常反应所用的底物或中间体水溶性差，因此在非水介质中的酶催化反应是推动该领域发展的关键技术。而多数酶在有机溶剂中不稳定、易失活，如何提高酶分子在有机溶剂中的稳定性成为了关键瓶颈。现有技术对在有机溶剂中进行酶催化的研究着重于酶催化介质工程、酶的物理化学修饰及固定化等技术，往往难以高效地改善酶的有机溶剂稳定性及催化反应效率，挖掘和开发在有机溶剂中具有高活性及高稳定性的酶类是十分迫切的，可提升生物催化工程的关键理论与技术。

Arnold等(J. Am. Chem. Soc. 113, 6336-6337)对α-裂解蛋白酶表面四个带电氨基酸残基进行定点饱和突变，获得的多个突变体在84%DMF中稳定性提高。Rhee等(Biochim. Biophys. Acta.-Protein Struct. Mol. Enzymol. 1547, 370-378)通过定向进化技术获得了磷脂酶A1的三个突变体（SA8、SA17及SA20）在50%DMSO中的半衰期约是野生型的4倍。Reetz (Chem. Commun. 46, 8657-8658)基于迭代饱和突变技术获得的枯草杆菌脂肪酶突变体在乙腈、DMSO及DMF等有机溶剂中的稳定性显著提高。Dalfard等(J. Biochem. 148, 231-238)通过定点突变提高了Salinivibrio proteolyticus来源的蛋白酶在多种有机溶剂中的稳定性，降低了其在有机相中的热失活速率。以上现有技术的文献显示出蛋白质分子改造手段对于提高酶在有机溶剂中的稳定性具有突出的优势，然而在实验水平上还没有成熟的相关理论报道，更没有可借鉴的分子改造方法。而运用定向进化策略对酶稳定性进行改造研究具有较高的可行性。

近年来蛋白酶在有机相中的反应多样性越来越受到人们的关注，其可进行合成小肽合成、糖轭合物，转酯反应以及动力学拆分等，在医药中间体、日用品、化妆品、生物材料等领域具有广泛的应用前景。然而大多数蛋白酶在有机相中也容易失活，因此，提高蛋白酶在有机相中的稳定性对于推动蛋白酶非水相生物催化应用的发展具有突出的意义。

发明内容

本发明的技术目的在于对本发明人团队在先授权专利的蛋白酶进行定向进化，以得到在有机溶剂中具有更高稳定性的蛋白酶；本发明的另一个技术目的在于提供该酶在有机相中催化小肽合成的应用，为有机相肽合成的工业化进程进一步提供基因资源。

一、本发明通过定向进化技术对铜绿假单胞菌来源的耐有机溶剂蛋白酶PT121基因（见授权中国申请，授权公告号CN 101240254 B）进行分子改造，使改造后的蛋白酶的突变体在有机溶剂稳定性方面更加优良。该耐有机溶剂蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No:1表示的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性比原出发蛋白酶大大提高。其中，所述的SEQ ID No:1是在先授权专利CN 101240254 B中所述的铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PT121所产的蛋白酶的成熟肽部分，编码301个氨基酸。

进一步地，所述的蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No:1表示的氨基酸序列表现出至少90%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性比原出发蛋白酶大大提高。

更进一步地，所述的蛋白酶突变体是通过用另一种氨基酸残基取代在由SEQ ID No:1表示的氨基酸序列表现出至少99%同源性的氨基酸序列的蛋白酶的下述位置、或其相应位置上的氨基酸残基而获得的蛋白酶突变体，且所述的氨基酸残基位置为SEQ ID No:1中的：第46位，和/或第224位；其在有机溶剂中稳定性比原出发蛋白酶大大提高。

更进一步地，所述的另一种氨基酸残基优选自下述的氨基酸：第46位：酪氨酸（氨基酸缩写名称为Y）；第224位：苯丙氨酸（氨基酸缩写名称为F）或酪氨酸（氨基酸缩写名称为Y）。