[发明专利]一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用咖啡浸膏的制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及烟用香料技术领域，具体是指一种食甲醇芽孢杆菌及其烟用咖啡浸膏的制备方法和应用。 

背景技术

在烟草制品中，烟草的香气和吸味至关重要，加香加料是卷烟工艺中的关键环节，是完善产品风格和提高卷烟香气质量的有效手段之一。目前烟用香料有化学合成香料和天然香料之分，均存在着各自的局限性。近年来，天然植物香料，因其天然无害，原料易得等原因，成为研发重点和热点。植物提取香料的开发由于可用植物资源的有限而存在局限性，将微生物发酵工程应用于香精香料的生物合成中，以天然植物资源为原料，利用微生物可以生产各种天然香料，是一种很好的解决途径。 

咖啡豆分水洗式和干燥式，平豆和圆豆。咖啡豆颜色有深有浅，通过堆积发酵和深度烘焙，咖啡豆爆开，体积膨胀一倍，而重量减少近1/4。咖啡豆在烘焙过程中逐渐生成挥发性风味油，使各种风味达到完美的平衡。咖啡豆即使是在同一生产国中也会因为各地区的气候、海拔、土质的不同，而微妙的影响及咖啡豆的风味及品质，以及产生各自的特征来。未经发酵的咖啡其风味及香气低劣。 

微生物在增殖过程中可产生庞大的高活性酶系，如多糖水解酶类、蛋白酶类、酯化酶类、氧化还原酶类及裂合酶类等，在酶促作用、化学作用及微生物体内复杂代谢的协同作用下，以咖啡为原料发生分解、降解、氧化、还原、聚合、偶联、转化等作用，形成复杂的低分子化合物，其中包括各种香味化合物，如醇类、醛类、酮类、酸类、脂类、酚类、吡喃类、 吡啶类和萜烯类等，这些香气物质无疑也是烟草或用于烟草的添加剂的香气组分。 

目前国内已经开始研究并利用生物发酵转化烟用浸膏，如CN101497844A报道一种采用微生物发酵咖啡制备烟用香料的方法，该方法有降低刺激，丰富和饱满烟气，掩盖杂气，使烟气柔和以及改善口感的作用，但是该方法利用的优势菌，该优势菌种类繁多，工业生产过程中生产条件难以控制，不适用于大规模工业化生产。 

发明内容

针对目前不足，本发明提供了一种食甲醇芽孢杆菌，该菌株名为Bacillus methylotrophicus VJ4-1，于2012年1月11日保藏于武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：M 2012004，其生物学特征是：是革兰氏阳性菌，能在10%NaCl中生长，有精氨酸双水解酶、鸟氨酸脱羧酶活性，能产酸、使牛奶液化；能以N-乙酰葡萄糖胺、甘露醇、葡萄糖、水杨素、D-蜜二糖、D-核糖、肌醇、蔗糖、麦芽糖、D-山梨醇、L-阿拉伯糖、DL-乳酸盐、L-丙氨酸糖原、L-脯氨酸组氨酸、柠檬酸盐为碳源的培养基上生长，其16S rRNA序列与Bacillus methylotrophicus的16S rRNA序列比对相似性达到100%。 

本发明提供一种利用食甲醇芽孢杆菌生物转化烟用咖啡浸膏的制备方法，包括以下步骤： 

1)将咖啡豆粉碎至10～200目，与水按质量比1∶20～40回流提取1～3小时后过滤，将滤液灭菌； 

2)斜面培养：将食甲醇芽孢杆菌接种到马铃薯葡萄糖琼脂斜面培养基上，在25～35℃、pH5～10条件下，静置培养24～72小时后置于冰箱中； 

3)制备种子培养液：用上述步骤2)中所得的斜面培养物，接种到种子培养基，在25～35℃，转速100～150rpm条件下振荡培养12～36h，连续转接1～4次后制得种子培养液； 

4)发酵：将种子培养液按体积比5～20％接种到上述步骤1)中的咖啡滤液中形成发酵液，上述发酵液的装罐量为20～40％，在pH4～10，温度25～40℃，转速100～200rpm，不避光条件下发酵7～14天； 

5)将步骤4)中所得的发酵液和95％乙醇按体积比1∶3～4，沉淀过夜后抽滤，将滤液减压浓缩除去溶剂，制得相对密度为1.20～1.36的烟用咖啡浸膏。 

优选地，所述斜面培养基为：马铃薯浸液200mL/L，葡萄糖20g/L，琼脂13g/L。 

优选地，所述种子液培养基组成为：麦芽糖50g/L，蛋白胨10g/L，氯化钠5g/L。 

本发明提供了一种所得烟用咖啡浸膏的应用，其特征在于：所述烟用咖啡浸膏加入卷烟中，用于协调烟气、增加淡甜香、果香、使烟气细腻柔和感、降低刺激、减少杂气、改善吸味，加入卷烟中烟用咖啡浸膏的质量比为0.05～0.15％。