[发明专利]一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，属于生物分离分析领域。

背景技术

寡核苷酸文库是一类含有10¹³-10¹⁵种不同碱基的DNA分子混合物，其中可能含有一种或数种与靶分子具有高特异性，高亲和性结合的DNA分子。核酸适配体(Aptamer)是指通过指数富集配体系统进化(SELEX)技术，从随机寡核苷酸文库中筛选得到的具有高亲和性和特异性的寡核苷酸序列配体。

核酸适配体亲和力高、特异性强、易制备及修饰、其靶分子分布广。目前，SELEX技术筛选核酸适配体的方法主要包括自动化SELEX、消减SELEX、毛细管电泳(CE)-SELEX、加尾SELEX、无引物基因组SELEX、切换SELEX等。

目前，毛细管电泳使分析检测方法从微升水平提升到纳升水平，已成为重要的分离分析技术，在生物、医药以及化工等领域具有广阔的应用前景。基于毛细管电泳分离分析方法的CE-SELEX技术因其快速、高效等特点，使适配体筛选周期缩短至传统SELEX技术的三分之一，大大加快了适配体筛选速度，受到适配体研究学者的青睐。

但是，传统的CE-SELEX技术是将初始的寡核苷酸文库直接与靶分子混合，得到与靶分子结合的DNA序列，再将这部分序列进行聚合酶链式反应(PCR)扩增，得到的产物为第二轮筛选的文库，然后重复进行。由于寡核苷酸文库容量庞大，使适配体筛选工作量大、耗时长(需要3～4天)，并要进行反复筛选(4～6轮)。因此需要提供一种寡核苷酸文库分级和评价方法，将文库进行分级分离后，找出与靶分子结合能力最强的次级库，再进行CE-SELEX技术，以减少筛选过程的时间和操作步骤。

发明内容

针对传统的CE-SELEX技术工作量大、耗时长，需要进行反复筛选的问题，本发明的目的在于提供一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，将寡核苷酸文库进行分级分离，并通过毛细管区带电泳在不同迁移时间段收集的次级库与同种靶分子的相互作用，找出与靶分子结合能力最强的次级库，再进行CE-SELEX技术，以减少筛选过程的时间和操作步骤。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：

一种基于毛细管区带电泳的寡核苷酸文库分级和评价方法，步骤如下：

步骤一、将寡核苷酸文库进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间分段收集得到次级库；

步骤二、将各次级库分别与同种靶分子混合，进行毛细管区带电泳，比较各次级库与靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库；

其中，毛细管区带电泳所用运行缓冲溶液为毛细管区带电泳领域中通常所使用的pH＞7.0的缓冲溶液。

其中，优选步骤一中，将寡核苷酸文库溶于运行缓冲溶液中制成储备液后，进行毛细管区带电泳，检测得到寡核苷酸文库电泳峰；再将所述储备液进行毛细管区带电泳，在寡核苷酸文库电泳峰宽时间范围内，按迁移时间进行分段收集，分段收集的样品为次级库；

电泳时，将储备液转移至毛细管区带电泳进样瓶中，采用压力进样，使储备液进入毛细管一端；然后加电压进行电泳，使储备液在毛细管内移动，检测得到寡核苷酸文库电泳峰；

优选步骤二中，将各次级库分别与同一种类且浓度相同的靶分子混合，冰上孵育后进行毛细管区带电泳，检测得到各次级库与靶分子混合后的毛细管区带电泳谱图；在毛细管区带电泳谱图中，复合物峰为各次级库中的DNA与靶分子结合产生的峰，游离DNA峰为没有与靶分子结合的各次级库中DNA产生的峰；利用面积归一化法，得到复合物的校正峰面积和游离DNA的校正峰面积，进一步计算复合物校正峰面积/(复合物校正峰面积+游离DNA校正峰面积)的百分比，简称为复合物校正峰面积百分比，比较不同次级库与同种靶分子相互作用的强弱，得到与靶分子结合能力最强的次级库。

其中，所用靶分子的浓度通过生物分析领域常规技术手段进行选择。

优选在步骤一中，将次级库收集在稀释10倍的运行缓冲液中。

优选在步骤一中，储备液中的寡核苷酸文库浓度为20μM。

优选在步骤一中，靶分子为牛凝血酶时，运行缓冲溶液为硼酸根离子浓度为80mM，pH＝8.0的硼酸-硼砂缓冲溶液。

优选在步骤二中，冰上孵育时间为0.5～2h。