[发明专利]桑树查尔酮异构酶基因及应用

说明书

技术领域

本发明涉及植物基因工程领域，特别是涉及桑树类黄酮化合物生物合成关键基因查尔酮异构酶基因及其应用。

背景技术

类黄酮是一类重要的植物次生代谢物质，是由两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物，小部分以游离形式存在，大部分与糖类合成苷类，以配基形式存在。桑树中类黄酮化合物种类丰富、分布广泛，主要有花色素、黄酮类、黄酮醇类、二氢黄酮醇类等四大类，药理研究证明桑树类黄酮化合物具有良好的抗氧化、降血糖、抗病菌、降血压、降血脂等功能。类黄酮合成途径中，查尔酮异构酶基因CHI是极为关键的限速酶，控制类黄酮的合成和组分分化，因此桑树查尔酮异构酶基因MaCHI可应用于桑树类黄酮生物合成的调控。

发明内容

本发明的目的之一在于提供桑树查尔酮异构酶基因核苷酸全序列、桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框ORF序列及3′端非编码区、桑树查尔酮异构酶基因编码的氨基酸序列，以及在此序列基础上进行密码子优化或点突变所产生的与原始序列相似度在90%以上的序列。针对桑树中类黄酮含量较低、提取成本高的困难，提供一个调控桑树类黄酮生物合成的基因以及在转基因植物中的应用。

本发明所述的桑树查尔酮异构酶基因MaCHI全长的克隆，依次通过以下步骤实现：

1）  根据蔷薇科植物草莓或苹果的查尔酮异构酶基因保守序列设计兼并引物，以桑树叶片基因组为模板，扩增桑树查尔酮异构酶基因的保守区域；

2）  基于获得的桑树查尔酮异构酶基因的保守区域设计基因特异引物，采用接头PCR获得保守区域的侧翼序列；

3）  采用软件sequencher（http://genecodes.com/）将获得的侧翼序列与保守区域序列进行拼接，采用NCBI网站的blastx程序预测拼接序列中含有的基因开放阅读框（ORF）及编码的氨基酸序列；

4）  以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因开放阅读框（ORF），并连接到pMD19-T Vector（TaKaRa），挑选阳性克隆并测序。     

本发明同时提供桑树查尔酮异构酶基因在桑树中的应用，即：采用CaMV35S启动子、35SPolyA以及桑树查尔酮异构酶基因MaCHI构建过表达查尔酮异构酶基因的植物表达载体，并采用农杆菌感染桑树丛生芽的方式获得转基因植株，具体步骤如下：

一、植物表达载体的构建：

1）  以pCMBIA2301质粒为模板，采用PCR法分别扩增得到35S启动子及35SPolyA片段，以桑树叶片cDNA为模板扩增桑树查尔酮异构酶基因MaCHI片段；

2）  将各片段分别插入植物表达载体pCMBIA2301的相应酶切位点中，构建成35S启动子-CHI-35SPolyA的表达盒，并进行序列测定；

二、桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的过表达：

1）利用冻融法将植物表达载体转入农杆菌，采取PCR法鉴定阳性克隆；

2）以桑树种子为材料进行组织培养获得丛生芽，构建具有相同遗传背景的无性繁殖系；

3）采用含植物表达载体的农杆菌感染丛生芽，获得转基因植株；

4）根据标记基因的序列设计引物对转基因苗子进行PCR检测；

5）以槲皮素为标准品，采用高效液相色谱（HPLC）技术检测转基因苗与对照组类黄酮含量的变化。

上述基因侧翼序列的克隆中，接头PCR为依赖于衔接头的侧翼序列分析方法。上述植物表达载体的构建中，CaMV35S启动子是花椰菜花叶病毒启动子，一种强启动子，被广泛应用于转基因植物中进行过量表达。35SPolyA为35S的终止序列。载体pCMBIA2301是目前常用的植物双元表达载体，含卡那的抗性以及Gus标记基因。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI的应用，将该基因应用于真核及原核表达。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于过量表达提高桑树类黄酮的含量。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于抑制查尔酮异构酶基因的表达获得新的转基因株系。

桑树查尔酮异构酶基因MaCHI应用于其他植物品种的转基因。

附图说明

图1为MaCHI保守区域PCR电泳图。M：Trans2000；1：MaCHI保守区域片段扩增