[发明专利]生物组织内源性成分的多模式多光子显微成像装置

说明书

技术领域

本发明涉及一种基于多模式的多光子显微技术对生物组织内源性不同成分的微结构进行成像的装置。

背景技术

1931年，物理学家梅耶(Maria Goppert-Mayer)在她的博士论文中提出多光子激发的概念。随着超短脉冲锁模激光器的问世，为多光子激发荧光分子提供了必要的高瞬时能量密度，以锁模激光器为光源，1990年Denk 和 Webb 实现了双光子激发荧光显微成像。随后，多光子显微成像技术迅速发展，至今，已经有包括双光子激发荧光(Two-photon excited fluorescence, 2PEF)、三光子激光荧光(Three-photon excited fluorescence，3PEF )、二次谐波(Second harmonic generation, SHG)和三次谐波(Third harmonic generation imaging, THG)等四种不同的多光子成像模式。生物组织的许多内源性成分在无须外加分子探针的情况就能产生较强的自体荧光和谐波信号，例如：弹力蛋白、角蛋白、还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸和黄素腺嘌呤二核苷酸等都能够通过双光子激发产生自体荧光；血清素、色氨酸和多巴胺等都能够通过三光子激发产生自体荧光；具有非中心对称结构的胶原蛋白、肌浆球蛋白、微管和骨格肌等能产生二次谐波信号；生物组织成分的不均匀性分布在超短脉冲激光的作用下，极易产生三次谐波，从而可以观察如细胞膜的微结构。不同模式的多光子显微成像可以展示生物组织内源性不同成分的微结构，在实际应用中通常采用不同模式相结合的多模式多光子显微成像方法。由于多光子成像的模式不同，需要的激光光源和探测装置也相应的不同，目前，主要采用的有其中两种或三种模式相结合的多模式多光子显微成像。若能够同时实现基于2PEF、3PEF、SHG和THG四种模式的多光子显微成像，将能够更全面地反映生物组织的生理病理状态变化引起的组织中不同成分的改变，从而拓展多光子显微技术在生物医学领域的应用。

发明内容

本发明的目的是提供一种基于多模式的多光子显微成像装置，该装置基于2PEF、3PEF、SHG和THG四种模式，可以对生物组织内源性不同成分的微结构进行全面的、高对比度的成像。

本发明的技术方案是这样实现的：由飞秒激光器产生的飞秒激光，通过分光镜将飞秒激光分成两路，其中第一路飞秒激光作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生波长比第一路飞秒激光长的激发光；其中第二路飞秒激光通过反射镜和延迟线，与第一路飞秒激光产生的激发光实现同步汇合，以形成汇合激光，该汇合激光通过第一双色分光镜入射到扫描器上，而后再通过第二双色分光镜并由物镜聚焦到检测样品上，汇合激光与检测样品产生的2PEF、3PEF、SHG和THG 光信号反向通过物镜收集，再由第二双色分光镜反射到探测系统，所述探测系统包括用于反射出2PEF、3PEF、SHG和THG 光信号的长通滤波片和分别设置在该些长通滤波片的反射光方向上的光电倍增管，所述光电倍增管将2PEF、3PEF、SHG和THG光信号分别转换成电信号，所述电信号分别接至计算机的输入端，由计算机同时显示来自生物组织内源性不同成分微结构的高对比度成像。

上述飞秒激光器采用钛宝石飞秒激光器，所述钛宝石飞秒激光器的激发波长选用800nm，作为泵浦光入射到光学参量振荡器后产生的激发光波长是1260nm。

上述分光镜为80/20分光镜，第一路飞秒激光为拥有80%能量的光，第二路飞秒激光为拥有20%能量的光。

汇合激光与检测样品产生的双光子激发荧光2PEF、三光子激光荧光3PEF、二次谐波SHG和三次谐波THG光信号反向通过相同的物镜收集，不经过扫描器直接由第二双色分光镜反射到探测系统，避免了因扫描器对产生光信号的衰减而影响三光子激光荧光和三次谐波光信号的探测，而且，来自组织的二次谐波光信号由两个光电倍增管转换成的两种电信号，分别接至计算机的输入端，在计算机内的叠加将提高组织二次谐波成像的亮度。

利用光学参量振荡器和延迟线，获得同时实现基于2PEF、3PEF、SHG和THG四种模式的多光子显微成像所需的1260nm 和800nm两种不同波长的同步激发光源。

上述的第一双色分光镜满足可透过1260nm并同时反射800nm的激发光。

上述的第二双色分光镜满足可透过飞秒激光器发出的入射光，同时反射飞秒激光与检测样品相互作用产生的发射信号光。

该些长通滤波片分别是390、410、430、620和640nm的长通滤波片。