[发明专利]一种PEG介导的原生质体瞬时转化方法及其专用试剂

权利要求书

1.一种用于转化的专用试剂，由溶质和溶剂组成；

所述溶质由甘露醇、Ca(NO₃)₂和PEG4000组成，所述甘露醇、所述Ca(NO₃)₂和所述PEG4000的配比为200mmol∶0.125mmol∶0.2g-0.8g。

2.根据权利要求1所述的专用试剂，其特征在于：所述甘露醇在所述专用试剂中的浓度为200mM；

所述Ca(NO₃)₂在所述专用试剂中的浓度为0.125mM；

所述PEG4000在所述专用试剂中的浓度为0.2g/ml-0.8g/ml。

3.根据权利要求1或2所述的专用试剂，其特征在于：所述PEG4000在所述专用试剂中的浓度为0.6g/ml；

所述溶剂为水。

4.一种制备权利要求1-3中任一所述专用试剂的方法，将权利要求1-3中任一所述专用试剂中的所述溶质按照所述配比溶于所述溶剂，得到所述专用试剂。

5.权利要求1-3中任一所述专用试剂在介导外源DNA转入果肉原生质体中的应用，所述果肉具体来源于苹果。

6.一种PEG介导的外源DNA转入果肉原生质体的方法，包括如下步骤：将外源DNA在权利要求1-3中任一所述专用试剂介导下转入果肉原生质体。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：所述方法包括如下步骤：

1)将所述外源DNA和含有果肉原生质体的悬浮液混匀，得到混合液1；

2)向所述混合液1中加入权利要求1-3中任一所述专用试剂混匀，静置，得到混合液2，将所述混合液2离心收集沉淀；

3)向所述沉淀中加入介导缓冲液混匀，得到反应体系，孵育所述反应体系，以实现外源DNA转入果肉原生质体。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于：

在反应体系中，所述外源DNA和所述含有果肉原生质体的悬浮液中的果肉原生质体的配比为5ug-15ug∶2×10³-10×10³个；所述外源DNA和所述含有果肉原生质体的悬浮液中的果肉原生质体的配比具体为10ug∶6×10³个；

在反应体系中，所述外源DNA和所述权利要求1-3中任一所述专用试剂中所述PEG4000的配比为：5ug-15ug∶0.04g-0.12g，所述外源DNA和所述权利要求1-3中任一所述专用试剂中所述PEG4000的配比具体为10ug∶0.12g。

9.根据权利要求7或8所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述外源DNA为质粒；

步骤2)中，所述静置时间为30min；所述离心的转速为100rpm，所述离心的时间为1min，所述离心半径为13.5cm；步骤3)中，所述孵育为黑暗孵育，所述孵育的时间为10-14h，所述孵育的时间具体为12h，所述孵育的温度为24℃。

10.根据权利要求7-9中任一所述的方法，其特征在于：

步骤1)中，所述含有果肉原生质体的悬浮液为将果肉原生质体用悬浮缓冲液悬浮得到；

所述悬浮缓冲液为将甘露醇、MgCl₂、2-N-吗啡啉乙磺酸和水混合，所述甘露醇在所述悬浮缓冲液中的浓度为400mM，所述MgCl₂在所述悬浮缓冲液中的浓度为15mM，所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述悬浮缓冲液中的浓度为4mM；

所述介导缓冲液为将NaCl、CaCl₂、KCl、葡萄糖、2-N-吗啡啉乙磺酸和水混合，所述NaCl在所述介导缓冲液中的浓度为154mM；所述CaCl₂在所述介导缓冲液中的浓度为125mM；所述KCl在所述介导缓冲液中的浓度为5mM；所述葡萄糖在所述介导缓冲液中的浓度为5mM；所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述介导缓冲液中的浓度为0.03％(质量百分含量)；所述果肉来源于苹果。