[发明专利]一种PEG介导的原生质体瞬时转化方法及其专用试剂

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种PEG介导的原生质体瞬时转化方法及其专用试剂。

背景技术

外源基因导入植物细胞中的表达方式分为稳定表达和瞬时表达，其中瞬时表达引入细胞的外源DNA和宿主细胞染色体DNA并不发生整合。这些DNA一般随载体进入细胞后12小时内就可以表达，并持续约80小时左右。植物瞬时表达有简单快速、表达水平高、安全有效等优点，在启动子分析、基因功能分析和生产重组蛋白方面用途广泛。

PEG介导的转化法可将外源基因转化到植物原生质体进行瞬时表达。应用在拟南芥、玉米等植物的PEG介导转化法已经相当完善。但应用在苹果果肉原生质体瞬时转化的PEG介导转化法还不完善，Ratnasiri(Plant Cell，Tissue and Organ Culture，2002)利用PEG介导法将带有GFP报告基因的目的载体转化到苹果果肉原生质体中，检测到转化成功的原生质体，但转化效率不到10％，这大大阻碍了后续研究的进行。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种用于转化的专用试剂。

本发明提供的专用试剂，由溶质和溶剂组成；

所述溶质由甘露醇、Ca(NO₃)₂和PEG4000组成，所述甘露醇、所述Ca(NO₃)₂和所述PEG4000的配比为200mmol∶0.125mmol∶0.2g-0.8g。

上述的专用试剂中，所述甘露醇在所述专用试剂中的浓度为200mM；

所述Ca(NO₃)₂在所述专用试剂中的浓度为0.125mM；

所述PEG4000在所述专用试剂中的浓度为0.2g/ml-0.8g/ml。

上述的专用试剂中，所述PEG4000在所述专用试剂中的浓度为0.6g/ml；

所述溶剂为水。

本发明的另一个目的是提供一种制备上述专用试剂的方法。

本发明提供的方法，将所述溶质按照所述配比溶于所述溶剂，得到所述专用试剂。

上述专用试剂在介导外源DNA转入果肉原生质体中的应用也是本发明保护的范围，所述果肉具体来源于苹果。

本发明的第三个目的是提供一种PEG介导的外源DNA转入果肉原生质体的方法。

本发明提供的方法，包括如下步骤：将外源DNA在上述专用试剂介导下转入果肉原生质体。

上述方法包括如下步骤：

1)将所述外源DNA和含有果肉原生质体的悬浮液混匀，得到混合液1；

2)向所述混合液1中加入上述专用试剂混匀，静置，得到混合液2，将所述混合液2离心收集沉淀；

3)向所述沉淀中加入介导缓冲液混匀，得到反应体系，孵育所述反应体系，以实现外源DNA转入果肉原生质体。

上述的方法中，在反应体系中，所述外源DNA和所述含有果肉原生质体的悬浮液中的果肉原生质体的配比为5ug-15ug∶2×10³-10×10³个；所述外源DNA和所述含有果肉原生质体的悬浮液中的果肉原生质体的配比具体为10ug∶6×10³个；

在反应体系中，所述外源DNA和所述权利要求1-3中任一所述专用试剂中所述PEG4000的配比为：5ug-15ug∶0.04g-0.12g，所述外源DNA和所述专用试剂中所述PEG4000的配比具体为10ug∶0.12g。

上述的方法中，步骤1)中，所述外源DNA为质粒，所述质粒具体为pEZS-NL质粒；

步骤2)中，所述静置时间为30min；所述离心的转速为100rpm，所述离心的时间为1min，所述离心半径为13.5cm；

步骤3)中，所述孵育为黑暗孵育，所述孵育的时间为10-14h，所述孵育的时间具体为12h，所述孵育的温度为24℃。

在步骤2)中的所述将所述混合液2离心收集沉淀前和得到所述混合液2的步骤间还包括向所述混合液2加入所述介导缓冲液混匀的步骤。

上述的方法中，

步骤1)中，所述含有果肉原生质体的悬浮液为将果肉原生质体用悬浮缓冲液悬浮得到；

所述悬浮缓冲液为将甘露醇、MgCl₂、2-N-吗啡啉乙磺酸(MES)和水混合，所述甘露醇在所述悬浮缓冲液中的浓度为400mM，所述MgCl₂在所述悬浮缓冲液中的浓度为15mM，所述2-N-吗啡啉乙磺酸在所述悬浮缓冲液中的浓度为4mM；