[发明专利]b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法。

背景技术

如今，流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae，Hi)仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Haemophi lus Influenzae type b，Hib)引起。Hib脑膜炎的危害居细菌性脑膜炎的首位，具有发病率高、病死率高和致残率高的特点；其另一个特点是发病年龄小，婴幼儿感染率高，发病年龄主要集中在5岁以下，尤其是2岁以下。据2006年世界卫生组织(WHO)报道，每年全世界Hib脑膜炎至少造成300万例严重疾病，其中约38.6万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在发展中国家，Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有很大比例，约占所有儿童肺炎的20％，是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。在亚洲22个国家的48项研究中，有2/3表明Hib是儿童非结核性脑膜炎的首要致病原。

我国3～5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低，为Hib感染高危人群。因此，我国有使用Hib疫苗的必要。

接种疫苗是预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。第一种Hib多糖疫苗于1985年4月在美国上市，这种疫苗适用于2～5岁的儿童。流行病学调查表明：6月龄前儿童就需要保护，然而，对于小于18月龄的儿童，这种采用PRP的疫苗的有效率为零，这成为该疫苗使用上的最大障碍和不足。

结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题，结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。结合疫苗于1987年投放市场，针对18月龄以上儿童。在随后几年间，三种新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作为结合蛋白。这些新疫苗在婴幼儿中非常有效。即使在小年龄婴儿中使用Hib疫苗，也是安全有效的。

上世纪90年代初，西欧、美洲等国家将Hib结合疫苗纳入常规儿童免疫规划，Hib侵袭性疾病的发病率迅速降低，甚至消失。目前，世界卫生组织(WHO)正致力于推动将其纳入其它国家的计划免疫程序中。至2004年，全球已有包括美洲、欧洲大部分地区和澳洲在内的94个国家将Hib疫苗纳入儿童免疫计划，另有15个国家在全球疫苗与免疫联盟(GAVI)的资助下使用这种疫苗，占全球所有国家和地区使用量的一半。至2007年，已经有112个国家纳入Hib疫苗计划免疫，3个国家部分纳入Hib疫苗。但在人口占世界1/2的亚洲，只有少数几个国家，如马来西亚和蒙古(GAVI资助)等将Hib疫苗纳入了计划免疫中。我国由于缺乏系统的Hib疾病流行病学资料，Hib疫苗尚未纳入中国计划免疫的范围。仅有部分城市开始推广使用Hib疫苗并获得了较好的效果。在农村和城市中低收入家庭，由于疫苗价格较高，限制了疫苗的普及。

制备Hib结合疫苗首先要获得Hib荚膜多糖，目前大规模生产Hib荚膜多糖的方法主要是通过发酵罐搅拌及深层通气的方式培养，当Hib细菌至对数生长期后期或静止期前期时，使用甲醛杀菌后去除菌体，收集发酵液上清液，再经后续一系列纯化工序后获得高纯度的Hib荚膜多糖。传统生产方式的Hib荚膜多糖产率较低，疫苗生产过程中的成本较高，这也是使Hib疫苗价格居高的其中一个原因。同时，由于Hib发酵液中含有较多的核酸及蛋白等杂质成分，增加了后续纯化的难度，为了获得高纯度的Hib荚膜多糖，只能增加纯化的工序，更进一步降低了Hib荚膜多糖的收率，使产量进一步下降。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种有效降低发酵液中核酸和蛋白等杂质含量、降低去除杂质蛋白所需的苯酚用量的、Hib荚膜多糖产量高的b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法。

本发明的目的是通过以下技术方案实现的：b型流感嗜血杆菌高密度培养生产细菌荚膜多糖的方法，它包括以下步骤：

(1)Hib菌种一至四代传代培养，它包括以下传代培养步骤：

A、第一代培养：开启Hib菌种传代至5～10mlHib液体培养基，放入恒温摇床振荡培养16～20h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35～37℃、回旋频率为250～330rpm；

B、第二代培养：将第一代培养所得的Hib菌种接种到10～20mlHib液体培养基，继续放入恒温摇床振荡培养6～8h，其中，恒温摇床振荡培养的温度为35～37℃、回旋频率为250～330rpm；