[发明专利]一种Hib多糖与蛋白结合工艺的优化方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种Hib多糖与蛋白结合工艺的优化方法。

背景技术

流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae，Hi)迄今为止仍是导致人类侵袭性疾病的主要致病菌，其中绝大部分由b型流感嗜血杆菌(Haemophilus Influenzae type b，Hib)引起。Hib脑膜炎居细菌性脑膜炎的首位，具有发病率高、病死率高和致残率高等特点，其发病年龄小，婴幼儿感染率高，发病年龄主要集中在5岁以下，尤其是2岁以下。据2006年世界卫生组织报告，全世界每年至少造成300万例严重疾病，其中约38.6万人死亡，已成为全球性的一大公共卫生问题。在发展中国家，Hib肺炎在儿童感染性疾病中占有重要地位，约占所有儿童肺炎的20％，是发展中国家儿童肺炎的重要死亡原因。在亚洲22个国家的48项研究中表明Hib是2/3儿童非结核性脑膜炎的首要致病原因。

接种疫苗是预防绝大多数Hib严重病例的唯一公共卫生措施。我国3～5岁儿童中Hib自然感染抗体水平低，为Hib感染高危人群。因此，我国有使用Hib疫苗的必要。

第一种Hib多糖疫苗于1985年4月在美国上市，这种疫苗适用于2～5岁的儿童。对于小于18月龄的儿童，这种采用PRP的疫苗的有效率实际为零，成为这种疫苗使用上的最大障碍。据流行病学调查表明，6月龄前儿童就需要保护。

结合疫苗的研制成功解决了疫苗在婴幼儿中无效的问题。结合疫苗比以往的疫苗具有更强的免疫原性和更好的免疫效果。结合疫苗于1987年投放市场，主要针对18月龄以上的儿童。在随后几年间，三种新的疫苗很快面市，采用了不同的蛋白作为结合蛋白。这些新疫苗在婴幼儿中非常有效。即使在小年龄的婴儿中使用Hib疫苗，也是安全有效的。

上世纪90年代初，西欧、美洲等国家将Hib结合疫苗纳入常规儿童免疫规划，Hib侵袭性疾病的发病率迅速降低或消失。目前，世界卫生组织(WHO)正致力于推动将其纳入其它国家的计划免疫程序中。至2004年全球已有包括美洲、欧洲大部分地区和澳洲在内的94个国家将Hib疫苗纳入儿童免疫计划，另有15个国家在全球疫苗与免疫联盟(GAVI)的资助下使用这种疫苗，占全球所有国家和地区使用量的一半。至2007年，已经有112个国家纳入Hib疫苗计划免疫，3个国家部分纳入Hib疫苗。但在人口占世界1/2的亚洲，只有少数几个国家，如马来西亚和蒙古(GAVI资助)等将Hib疫苗纳入计划免疫中。中国由于缺乏系统的Hib疾病的流行病学资料，Hib疫苗尚未纳入中国计划免疫的范围。仅有部分城市开始推广使用Hib疫苗并获得了较好的效果。由于疫苗价格较高，在农村和城市中低收入家庭根本没有能力购买，从而限制了疫苗的普遍使用。

在Hib结合疫苗制备的过程中，Hib荚膜多糖与蛋白载体偶联是关键的步骤。目前普遍运用的结合方法是：用CNBr活化Hib荚膜多糖后连接己二酰肼，然后在碳二亚胺的催化作用下Hib荚膜多糖通过己二酰肼的桥连作用与载体蛋白结合。但该结合方法的合格结合物收率很低，目前业内该结合方法的Hib荚膜多糖收率仅4～6％，因此，为提高合格结合物收率，对结合工艺进行改进是有实际意义的。

发明内容

本发明的目的即在于克服现有技术的不足，提供一种Hib多糖与蛋白结合工艺的优化方法，通过使用癸二酸二酰肼(SDH)作为多糖与载体蛋白结合的新的桥连物，在原来的方法上，通过改变桥连分子，使结合反应更有效地进行，继而提高多糖与载体蛋白的结合率，缩短结合反应时间，并使结合反应的合格结合物收率得到一定程度提高，结合反应重复性很高，有利于大规模生产，降低了生产成本。

本发明的目的是通过以下技术方案来实现：一种Hib多糖与蛋白结合工艺的优化方法，它包括以下多糖衍化、多糖-TT结合物制备两个步骤，其中，所述的多糖衍化包括以下子步骤：

S11：在精制Hib荚膜多糖中加入注射用水，稀释成终浓度为1～2mg/ml的多糖溶液；

S12：加入0.1～0.4倍于多糖质量的CNBr，进行活化处理；

S13：活化完成后，加入3～5倍于多糖质量的SDH，进行偶联反应；

S14：将偶联反应所得的反应物分装于透析袋内，并置于0.02～0.08mol/L的NaCl溶液中透析2～3次，每次透析8～12小时，去除残余氰化物，然后超滤浓缩至原体积，得到多糖-SDH衍生物；

所述的多糖-TT结合物制备包括以下子步骤：