[发明专利]梨小食心虫成虫触角总RNA的提取方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种小型蛾类昆虫触角总RNA的提取方法，具体说是梨小食心虫成虫触角总RNA的提取方法。

背景技术

梨小食心虫Grapholita molesta(Busck)是一种严重危害桃、梨等果树的世界性重要害虫，在我国广泛分布于除西藏以外的所有省市自治区。近年来，由于农业生产产业结构的调整，水果栽培模式和管理措施的变化等因素的影响，梨小食心虫在我国许多地方连年大发生，不但给果业生产造成了巨大的经济损失，而且严重地挫伤了广大果农的生产积极性。已成为制约梨、桃等果业生产进一步向优质、高产、稳产方向发展的重要因素之一。

长期以来，对梨小食心虫的防治主要以果实套袋和化学农药为主，前者虽然环保且效果较好，但操作费工、费时，成本随劳动力价格的上涨已很难使果农接受。在许多地方，果实套袋的投资已达1000元/亩左右。化学防治则因梨小食心虫钻蛀危害，隐蔽性强而使效果较差；加之该虫一年多代，需多次用药，不仅引起抗药性日渐增强，而且导致果品农药残留和环境污染加重。因此，探索梨小食心虫低成本且高效无害化的防治方法已成为桃、梨生产中亟待解决的突出问题，势在必行。

研究表明，昆虫能够感受空气中的挥发物质，并依此作为寻偶，觅食和寻找产卵场所的信息。而昆虫触角感受器中的气味结合蛋白与脂溶性的气味物质的结合，是昆虫专一性识别外界气味化合物的第一步生化反应，这对于昆虫与外界信息化合物的交流意义重大。对此进行深入研究可为农业害虫防治提供新的思路与途径，为研制开发无污染、不杀伤天敌、与环境友好的高效驱避剂和引诱剂提供理论依据。

对气味结合蛋白研究的经典方法是直接从昆虫触角中提取粗蛋白，然后通过聚丙烯酰氨凝胶电泳、凝胶层析离子交换柱等方法进行分离纯化得到昆虫气味结合蛋白，但是大部分昆虫触角很小，要分离纯化比较困难，且该过程比较繁琐。近年来，科学家们利用发展起来的分子生物学技术克隆得到气味结合蛋白的基因，再利用体外表达的方法获得足量目的蛋白，这从一定程度上缓解了研究气味结合蛋白的难度。但是该方法也必须先从昆虫触角中提取总RNA，这对于触角较大的昆虫不难做到，可是像梨小食心虫这类小型蛾类昆虫却不是易事，如果没有一套完整有效的提取方法很容易使RNA降解使后续实验无法进行实施。

发明内容

针对像梨小食心虫成虫这类小型蛾类昆虫不易提取高质量触角总RNA的问题，本发明的目的在于，提供一种简便有效的梨小食心虫成虫触角总RNA的提取方法。

为了实现上述任务，本发明采取如下的技术解决方案：

一种梨小食心虫成虫触角总RNA的提取方法，将昆虫在低温条件下冷冻昏迷，用小型医用剪刀和镊子将数根触角剪下，并立即置于浸在液氮中的1.5ml离心管中，然后从液氨中取出离心管并马上加入少量总RNA提取液，用匀浆器将其充分匀浆后加入足量总RNA提取液，移液器吹打数次后转入另一新离心管中，然后按照总RNA提取方法，经氯仿抽提，异丙醇和乙醇沉淀分离得到高纯度的总RNA。

本发明的能方法简单方便有效，解决RNA在提取过程中降解的问题，可以获得高质量的总RNA，满足后续实验的要求。

附图说明

图1是梨小食心虫雌雄成虫触角总RNA完整性检测电泳图；图中，泳道1为雌成虫触角总RNA，泳道2为雄成虫触角总RNA。

图2是梨小食心虫雌雄成虫触角总RNA反转录的cDNA模板对气味结合蛋白基因PCR扩增结果的检测电泳图；图中，M为DNALD2000Marker；泳道1为雌成虫总RNA反转录cDNA模板对梨小食心虫普通气味结合蛋白2基因PCR扩增结果；泳道2为雄成虫总RNA反转录cDNA模板对梨小食心虫普通气味结合蛋白2基因PCR扩增结果；

图3是梨小食心虫雌雄成虫触角总RNA反转录的cDNA模板对内参基因Actin PCR扩增结果的检测电泳图；图中，M为DNA LD2000Marker；泳道1为雌成虫总RNA反转录cDNA模板对梨小食心虫Actin基因PCR扩增结果；泳道2为雄成虫总RNA反转录cDNA模板对梨小食心虫Actin基因PCR扩增结果。

为了清楚的理解本发明，以下结合附图和实施例对本发明作进一步的详细说明，本发明不限于以下实施例。

具体实施方式

本实施例给出一种梨小食心虫成虫触角总RNA的提取方法，具体按下列步骤实施：