[发明专利]黄牛I‑mfa基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于分子遗传学领域，涉及以黄牛的功能基因的单核苷酸多态性(SNP)作为分子遗传标记，特别涉及黄牛I-mfa基因的单核苷酸多态性位点及其检测方法。

背景技术

黄牛是我国的主要的家畜之一，但是现在面临着优秀黄牛品种种源不足和种群遗传品质较差的压力。传统的育种方法应用测试动物的表现型和其亲代、祖代及其它亲属在小动物模型中的遗传信息，设想性状受到许多基因遗传差异的影响，每个基因对性状有相对较小的贡献，因此对性状的估计不可避免有些偏差。分子遗传标记是近年来现代遗传学发展最快的领域之一，新的方法正在不断涌现，已定位的标记基因数目与日俱增。这将为数量遗传学提供了分子水平信息，家畜育种也将跨入分子育种阶段。应用分子遗传标记的现代育种技术是加快良种选育和提高种群遗传品质，从而增加黄牛的产肉量和改善肉品质的先进的有效的方法。

分子遗传标记辅助选择就是将现代生物技术与常规选择方法相结合，通过对遗传标记的选择来间接选择控制某性状的数量性状位点(QTL)，使之能够同时利用标记位点信息和数量性状的表型信息，更准确估计动物个体的育种值，提高选择效率，加快育种进展。标记辅助选择主要经历了三个阶段：第一阶段是家畜各性状间的遗传分析；第二阶段是蛋白质(酶)标记对数量性状的标记阶段；第三个阶段是分子遗传标记阶段。随着分子标记技术日渐成熟与丰富，使覆盖整个基因组的标记成为可能，通过与QTL间的连锁分析，实现分子标记辅助选择的目标。

单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism，SNP)就是指基因组DNA序列中由于单个核苷酸(A/T/C/G)的替换而引起的多态性。因此，通常所说的SNP包括碱基的替换、插入、缺失以及重复序列拷贝数的变化。一个SNP表示在基因组某个位点上有一个核苷酸的变化，主要由单个碱基的转换或者颠换所引起；具有转换型变异的SNP约占2/3，其他几种SNP在相似的水平上。CpG二核苷酸的胞嘧啶是基因组中最易发生突变的位点，其中大多数是甲基化的，可自发地脱去氨基而形成胸腺嘧啶。

SNP作为新的遗传标记已广泛应用于基因定位、克隆、遗传育种及多样性的研究。SNP是基因组中存在的一种数量非常丰富的变异形式，占人类基因组中遗传多态性的90％以上。SNP与罕见的变异不同，通常在种群中频率等于或小于1％的此种变异被称为突变，而只有频率大于1％时才被称为单核苷酸多态性。

目前，主要采用几种不同的方法来发现SNPs：DNA序列测定方法、PCR-SSCP与DNA测序结合法、AS-PCR方法、PCR-RFLP法、TaqMam技术与分子信标(molecular beacons)等。在这些SNP检测技术中，(1)DNA序列测定法是最为准确的SNP检测方法，但是，其检测费用极其昂贵，且需要有DNA测序仪等大型仪器，同时，在测序过程中需要非常熟练的技术人员和经验，所以，DNA序列测定法不是一种应用于生产实际的理想SNP检测方法；(2)PCR-SSCP与DNA测序结合法检测SNP可以适当降低检测费用，但是，PCR-SSCP的实验过程比较长，操作比较繁琐，且实验过程中存在假阳性问题，所以，也并非理想的SNP检测手段；(3)AS-PCR方法作为一种新型的SNP检测方法，在未来的应用领域中具有非常广阔的前景，但是，该方法需要设计特别的引物，且只能针对特定的基因位点，同时，检测过程中还存在误检的概率，因此，目前不具有普遍应用的特点；(4)TaqMam技术与分子信标(Molecular Beacons)都是在荧光能量转移(fluorescence resornance energ transfer，FRET)基础上建立起来的，利用荧光标记及仪器达到检测目的。焦磷酸测序(pyrosequencing)则是利用测序过程中可释放的焦磷酸和酶类产生荧光，是不依赖平板胶或毛细管电泳、不依赖DNA的荧光标记技术，很可能成为未来的主流技术。(5)RFLP-PCR方法是一种检测SNP的有效技术，在发现SNP位点后引入限制性内切酶进行切割，然后进行琼脂糖、聚丙烯凝胶电泳分析，就能准确地鉴别SNP位点。RFLP-PCR方法不仅具有DNA测序法的准确性，又克服了费用昂贵、繁琐操作、假阳性的缺点，而且所检测的序列位点无特殊性要求。