[发明专利]一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法

权利要求书

1.一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法，其特征在于，包括以下步骤：（1）样本采集及处理；（2）肠道内容物细菌总DNA的提取；（3）PCR扩增及纯化；（4）DGGE成像；（5）目的条带的回收、克隆及测序；（6）分析。

2.如权利要求1所述的一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样本采集及处理：每种鱼类需要n个重复样本，其中，n大于5，分别收集每个样本的肠道内容物，将n个重复样本的肠道内容物混合均匀后保存备用；

（2）肠道内容物细菌总DNA的提取：肠道内容物细菌总DNA的提取采用Stool Mini Kit 试剂盒；

（3）PCR扩增及纯化：根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一个30-40 bp的GC发夹结构，使用引物对肠道内容物细菌总DNA进行PCR扩增；

（4）DGGE成像：PCR产物采用Bio-Rad DCodeTM突变检测系统进行DGGE凝胶电泳，其中凝胶梯度为35 ％～55 ％，缓冲液为1×TAE Buffer，变性方向与电泳方向一致，银染，然后利用白光投射仪对凝胶进行成像，并用软件BIO-RAD Quantity One 4.3.1进行图像分析，其中，每条DGGE泳道代表的是肠道内容物细菌的平均状态，不同位置的条带代表不同的细菌，而条带亮度反映细菌的相对量；

（5）目的条带的回收、克隆及测序：将肠道内容物细菌DGGE图谱中清晰的共性和特异条带标记割胶回收，加入TE(pH 8.0)浸泡过夜取上清作模板进行扩增，所用引物为在所述步骤（2）的通用引物基础上将上游引物去掉添加的GC发卡结构，将得到的PCR产物纯化，与载体连接，转化感受态细胞，挑选阳性克隆子测序；

（6）分析：将测序的序列利用BLAST程序进行相似性分析，确定鱼类肠道内容物的特异菌；利用从构建的肠道内容物细菌特异性DGGE图谱得出的可见条带的数目、亮度、位置等特异性数据，追溯鱼类地理来源，同时确定的鱼类肠道内容物的特异菌作为鱼类地理来源的参考指标。

3.如权利要求2所述的一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）样本采集及处理：每种鱼类需要n个重复样本，其中，n大于5，分别收集每个样本的肠道内容物，将n个重复样本的肠道内容物混合均匀后保存备用；

（2）肠道内容物细菌总DNA的分别提取：肠道内容物细菌总DNA的提取采用Stool Mini Kit 试剂盒；

（3）PCR扩增及纯化：根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一个30-40 bp的GC发夹结构，引物为V338 F-GC：5-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3及V534 R：5-ATTAC CGCGG CTGCT GG-3，使用引物V338F-GC和V534R对肠道内容物细菌总DNA进行PCR扩增，反应体系为：dNTP Mixture（10mmol/L）1 μL，10×PCR Buffer（含Mg²⁺） 5 μL，V338 F-GC（20nmol/μL）1 μL，V534R（20nmol/μL） 1 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，加双蒸水至50 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，65~55 ℃退火30 s（每个循环降落0.5 ℃），72 ℃延伸1 min，20个循环；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，10个循环；72 ℃延伸10 min；

（4）DGGE成像：PCR产物采用Bio-Rad DCodeTM突变检测系统进行DGGE凝胶电泳，其中凝胶梯度为35 ％～55 ％，缓冲液为1×TAE Buffer，变性方向与电泳方向一致，电泳条件：电泳温度为60 ℃，首先在200 V下电泳 5 min，然后在 80 V 电泳 12 h，银染，然后利用白光投射仪对凝胶进行成像，并用软件BIO-RAD Quantity One 4.3.1进行图像分析，其中每条DGGE泳道代表的是肠道内容物细菌的平均状态，不同位置的条带代表不同的细菌，而条带亮度反映细菌的相对量；

（5）目的条带的回收、克隆及测序：将肠道内容物细菌DGGE图谱中清晰的共性和特异条带标记割胶回收，加入TE(pH 8.0)浸泡过夜取上清作模板进行扩增，所用引物为V338F：5-ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3及V534R：5-ATTAC CGCGG CTGCT GG-3，反应体系为：dNTP Mixture（10mmol/L）1 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+） 5 μL，V338F（20nmol/μL） 1 μL，V534R（20nmol/μL） 1 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，加双蒸水至50 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65~55 ℃退火30 s（每个循环降落0.5℃），72 ℃延伸1min，20个循环；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，10个循环；72 ℃延伸10 min，将得到的PCR产物纯化，与载体连接，转化感受态细胞，挑选阳性克隆子测序；

（6）分析：将测序的序列利用BLAST程序进行相似性分析，确定鱼类肠道内容物的特异菌；利用从构建的肠道内容物细菌特异性DGGE图谱得出的可见条带的数目、亮度、位置等特异性数据，追溯鱼类地理来源，同时确定的鱼类肠道内容物的特异菌作为鱼类地理来源的参考指标。

4.如权利要求1-3所述的一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法，其特征在于，在所述方法中还包括收集肠道壁、提取肠道壁细菌总DNA、对肠道壁细菌总DNA进行PCR扩增及纯化、肠道壁细菌DGGE成像，及结合肠道壁细菌DGGE图谱进行鱼类地理来源的确定，具体包括以下步骤：

（1）样本采集及处理：每种鱼类需要n个重复样本，其中，n大于5，分别收集每个样本的肠道内容物，将n个重复样本的肠道内容物及肠道壁分别混合均匀后保存备用；

（2）肠道壁细菌总DNA及肠道内容物细菌总DNA的分别提取：肠道壁细菌总DNA的提取流程为：用无菌剪刀剪取1g的片段，放于灭菌离心管A中，加入1ml 1×TE Buffer，最大转速涡旋5min重悬菌体至溶液，尽量转移上清液至新的2ml离心管中，再加入1ml 1×TE Buffer至原离心管A中，重复所述操作；肠道内容物细菌总DNA的提取采用Stool Mini Kit 试剂盒；

（3）PCR扩增及纯化：根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一个30-40bp的GC发夹结构，引物为V338 F-GC：5-CGCCC GCCGC GCGCG GCGGG CGGGG CGGGG GCACG GGGGG ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3及V534 R：5-ATTAC CGCGG CTGCT GG-3，使用引物V338F-GC和V534R对肠道壁细菌总DNA及肠道内容物细菌总DNA分别进行PCR扩增，反应体系为：dNTP Mixture（10mmol/L）1 μL，10×PCR Buffer（含Mg²⁺） 5 μL，V338 F-GC（20nmol/μL）1 μL，V534R（20nmol/μL） 1 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，加双蒸水至50 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，65~55 ℃退火30 s（每个循环降落0.5 ℃），72 ℃延伸1 min，20个循环；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，10个循环；72 ℃延伸10 min；

（4）DGGE成像：PCR产物采用Bio-Rad DCodeTM突变检测系统进行DGGE凝胶电泳，其中凝胶梯度为35 ％～55 ％，缓冲液为1×TAE Buffer，变性方向与电泳方向一致，电泳条件为：电泳温度为60 ℃，首先在200 V下电泳 5 min，然后在 80 V 电泳 12 h，银染，然后利用白光投射仪对凝胶进行成像，并用软件BIO-RAD Quantity One 4.3.1进行图像分析，其中每条DGGE泳道代表的是肠道壁细菌或肠道内容物细菌的平均状态，不同位置的条带代表不同的细菌，而条带亮度反映细菌的相对量；

（5）目的条带的回收、克隆及测序：将肠道内容物细菌DGGE图谱中清晰的共性和特异条带标记割胶回收，加入TE(pH 8.0)浸泡过夜取上清作模板进行扩增，所用引物为V338F：5-ACTCC TACGG GAGGC AGCAG-3及V534R：5-ATTAC CGCGG CTGCT GG-3，反应体系为：dNTP Mixture（10mmol/L）1 μL，10×PCR Buffer（含Mg2+） 5 μL，V338F（20nmol/μL） 1 μL，V534R（20nmol/μL） 1 μL，Taq 酶（5 U/μL）0.5 μL，模板 DNA 1 μL，加双蒸水至50 μL，PCR反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，65~55 ℃退火30 s（每个循环降落0.5℃），72 ℃延伸1min，20个循环；94 ℃变性 30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃ 延伸1 min，10个循环；72 ℃延伸10 min，将得到的PCR产物纯化，与载体连接，转化感受态细胞，挑选阳性克隆子测序；

（6）分析：将测序的序列利用BLAST程序进行相似性分析，确定鱼类肠道内容物的特异菌；利用从构建的肠道内容物细菌特异性DGGE图谱及肠道壁细菌特异性DGGE图谱得出的可见条带的数目、亮度、位置等特异性数据，追溯鱼类地理来源，同时确定的鱼类肠道内容物的特异菌作为鱼类地理来源的参考指标。