[发明专利]一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，具体地说，是一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法。

背景技术

在经济全球化和食品贸易全球化的大背景下，食品安全问题成为各国重点关注的焦点之一，尤其在疯牛病、口蹄疫、禽流感等事件频频发生的当今社会，食品安全更是成为了各国首要控制和解决的问题之一。可追溯系统的产生起因于1996年英国疯牛病引发的恐慌，同时另两起食品安全事件—丹麦的猪肉沙门氏菌污染事件和苏格兰大肠杆菌事件（导致21人死亡）也使得欧盟消费者对政府食品安全监管缺乏信心，这些食品安全危机促进了可追溯系统的建立。至此，畜产品可追溯系统首先在欧盟范围内产生建立，通过食品的可追溯管理为消费者提供关于所消费食品更加详尽的信息。

自2003年来，我国水产品出口量一直稳居世界第一，但我国水产品出口贸易受到的限制也逐渐增加。欧洲在2002年强制要求在欧盟国家销售的所有食品必须可追溯（条例No.178/2002），而确定地理来源是食品跟踪和追溯的一个重要指标。研究发现，基于食品中细菌菌群指纹图谱追溯食品来源的方法具有很好的可靠性，意大利学者Ercolini在2004年通过PCR-DGGE（聚合酶链反应-变性梯度凝胶电泳）技术构建食品细菌群落指纹图谱来追溯食品来源。PCR-DGGE技术首次由Fisher 和Lerman（1979）提出，用于DNA突变的检测；此后Muyzer 等（1993）将此技术用于微生物生态学研究。近年来，该技术在肠道菌群研究中优势突出，许多无法培养的菌种利用该项技术被鉴定出来。目前，PCR-DGGE技术应用于我国主养水产品的追溯研究还未见报道。

目前，我国主养水产品的追溯主要是依靠追溯条形码、水产品相关记录等方法。但这些方法存在以下不足：首先，我国还没有针对水产品可追溯性的可操作的法规和标准，特别是水产品追溯需要的信息代码标准、水产品标签标准（有别于预包装食品标签标准）及统一的信息采集规范等；其次，生产和流通环节的基本信息采集困难，还没有具有自主知识产权的水产品可追溯相关技术成果；最后，水产品多数个头不大，生活在水中，不容易标记和管理，而且又容易引发疾病。

发明内容

针对以上不足，本发明提供一种通过基于鱼类肠道微生物16S rDNA 构建的PCR-DGGE指纹图谱及在此基础上得出的特异菌来确定鱼类地理来源的方法。

本发明通过以下方案达到上述目的：

一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法，包括以下步骤：（1）样本采集及处理；（2）肠道内容物细菌总DNA的提取；（3）PCR扩增及纯化；（4）DGGE成像；（5）目的条带的回收、克隆及测序；（6）分析。

优选的，一种基于PCR-DGGE技术确定鱼类地理来源的方法，包括以下步骤：

（1）样本采集及处理：每种鱼类需要n个重复样本，其中，n大于5，分别收集每个样本的肠道内容物，将n个重复样本的肠道内容物混合均匀后保存备用；

（2）肠道内容物细菌总DNA的提取：肠道内容物细菌总DNA的提取采用Stool Mini Kit 试剂盒；

（3）PCR扩增及纯化：根据细菌16S rDNA V3可变区设计一对通用引物，其中，在上游引物的5’末端添加一个30-40 bp的GC发夹结构，使用引物对肠道内容物细菌总DNA进行PCR扩增；

（4）DGGE成像：PCR产物采用Bio-Rad DCodeTM突变检测系统进行DGGE凝胶电泳，其中凝胶梯度为35 ％～55 ％，缓冲液为1×TAE Buffer，变性方向与电泳方向一致，银染，然后利用白光投射仪对凝胶进行成像，并用软件BIO-RAD Quantity One 4.3.1进行图像分析，其中，每条DGGE泳道代表的是肠道内容物细菌的平均状态，不同位置的条带代表不同的细菌，而条带亮度反映细菌的相对量；

（5）目的条带的回收、克隆及测序：将肠道内容物细菌DGGE图谱中清晰的共性和特异条带标记割胶回收，加入TE(pH 8.0)浸泡过夜取上清作模板进行扩增，所用引物为在所述步骤（2）的通用引物基础上将上游引物去掉添加的GC发卡结构，将得到的PCR产物纯化，与载体连接，转化感受态细胞，挑选阳性克隆子测序；

（6）分析：将测序的序列利用BLAST程序进行相似性分析，确定鱼类肠道内容物的特异菌；利用从构建的肠道内容物细菌特异性DGGE图谱得出的可见条带的数目、亮度、位置等特异性数据，追溯鱼类地理来源，同时确定的鱼类肠道内容物的特异菌作为鱼类地理来源的参考指标。