[发明专利]一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体及其制备方法和应用。 

背景技术

玉米赤霉烯酮（Zenralenone, ZEN）是由多种镰刀菌产生的一种类雌激素样的真菌毒素，污染范围广泛，谷实类原料在田间、收获过程、收获后储藏期间以及饲料和食品成品储存、使用等诸多环节，都有可能受到ZEN 的污染。ZEN具有较强生殖毒性和致畸作用，可引起动物发生雌激素亢进症，导致动物不孕或流产，对猪、家禽、反刍动物均影响较大，给畜牧业带来很大经济损失；ZEN还具有细胞毒性、免疫毒性、肝毒性、潜在致癌性等，并且ZEN对高温稳定，不易去除，严重危害人类健康。目前大多数国家对食品、谷物、饲料中ZEN 含量进行了严格限定。 

目前，免疫检测方法已成为食品安全快速检测的重要方法之一，在食品安全检测中发挥了重要作用。ZEN是一种小分子毒素，目前用于ZEN残留检测的免疫学方法存在有以下缺陷：（1）ZEN标准品的使用不仅给操作人员带来危害，同时也增加了环境中有毒有害物质的排放；（2）检测中需用到固相抗原（包被原ZEN-载体蛋白），但在包被原的制备过程中通常难以保证每个载体蛋白都连接相同数目的ZEN，因而存在重复性差的现象；（3）ZEN-载体蛋白竞争物通常稳定性不好，是影响检测试剂盒保质期的主要因素之一。因此，寻求ZEN的替代物用于ZEN的无毒检测具有重要的现实意义。β型抗独特型抗体（β-Anti- idiotype antibody，β-AId or Ab2β）具有与（半）抗原相同抗原决定簇的“内影像”作用，因而可以替代小分子物质。 

发明内容

本发明的目的在于针对现有技术中的上述不足，提供一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体其制备方法和应用。 

本发明通过以下技术方案实现上述目的： 

杂交瘤细胞株1D5，是由ZEN单抗免疫小鼠得到的脾细胞与小鼠骨髓瘤细胞融合而成，于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201238。 

 一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体，该玉米赤霉烯酮抗独特型抗体为β型抗独特型抗体，与玉米赤霉烯酮存在“内影像”关系，该玉米赤霉烯酮抗独特型抗体是由上述杂交瘤细胞株1D5分泌得到的。 

一种玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法，步骤如下： 

（1）制备ZEN单克隆抗体：采用活泼酯法将ZEN与OVA偶联制备免疫抗原，ZEN与BSA偶联制备检测抗原，免疫BALB/c小鼠，细胞融合，经过筛选后获得一株杂交瘤细胞，通过小鼠体内诱生法制备腹水型ZEN单克隆抗体；

（2）以ZEN单克隆抗体为免疫原，免疫小鼠，细胞融合，得到杂交瘤细胞株1D5，诱导分泌抗体；以ZEN为竞争物，通过竞争ELISA筛选最终得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。

上述制备方法中，步骤（1）所述细胞融合后得到的杂交瘤细胞命名为1G4G10D3（杂交瘤细胞1G4G10D3），于2012年4月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号CCTCC NO：C201237。 

步骤（2）具体方法为：ZEN单克隆抗体与KLH偶联，偶联物免疫BALB/c小鼠，经血清效价和灵敏度检测合格后，再进行偶联物腹腔注射小鼠，3天后取小鼠脾细胞，与骨髓瘤细胞融合，用HAT或HT选择培养基培养融合细胞，同时采用间接ELISA和间接竞争ELISA法筛选阳性克隆，得到杂交瘤细胞株1D5，分泌产物经过纯化，得到玉米赤霉烯酮抗独特型抗体。 

上述玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的制备方法中，也可以使用市售的ZEN单抗直接进行步骤（2）的操作。 

本发明的玉米赤霉烯酮抗独特型抗体在玉米赤霉烯酮检测中的应用，具体是利用ZEN单克隆抗体和玉米赤霉烯酮抗独特型抗体建立ZEN的竞争ELISA，进行无毒检测。 

一种利用玉米赤霉烯酮抗独特型抗体检测玉米赤霉烯酮的方法，步骤为： 

（1）用生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体；

（2）间接ELISA确定生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的效价；

（3）检测ZEN对生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与ZEN单抗结合的抑制，同时检测玉米赤霉烯酮抗独特型抗体对生物素标记玉米赤霉烯酮抗独特型抗体与ZEN单抗结合的抑制，分别绘制ZEN和玉米赤霉烯酮抗独特型抗体的抑制曲线及其相应线性回归方程；根据抑制率在20%-80%间，在相同抑制率条件下，ZEN与抗ZEN单抗独特型抗体间浓度对应关系，绘制ZEN替代标准曲线及对应的线性回归方程，作为定量换算公式；