[发明专利]一种低免疫原性蚓激酶及其制备方法和应用

权利要求书

1.一种制备低免疫原性蚓激酶的方法，其特征在于包括首先从蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然后粗品通过离子交换柱进行洗脱，纯化，收集具有纤溶活性的组分，冷冻干燥浓缩，浓缩后的蚓激酶溶液用凝胶过滤色谱柱进行分离，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测纤溶活性，收集具有纤溶活性的第二个洗脱峰，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量为23500-27500Da，洗脱峰经透析脱盐低温冷冻干燥后采用活化的单甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐对其进行分子修饰，即得。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于：具体的，包括以下步骤：

(1)蚓激酶粗品的制备：

取新鲜蚯蚓，水洗数次，清水浸泡除去内脏中的污物，然后加入水，并加入苯甲酸钠防腐，置于40℃-50℃水浴加热自溶8-10h，离心，弃去沉淀，抽滤；滤液加入固体(NH₄)₂SO₄使得(NH₄)₂SO₄的浓度为30-40％，在4℃下保存3h-5h，用离心机离心，取得上清液，加(NH₄)₂SO₄使得(NH₄)₂SO₄的浓度为60-80％，离心，收集沉淀，用去离子水溶解，用透析袋透析2-3天，脱盐，然后用截流分子量为10000WM的超滤膜超滤浓缩，低温冷冻干燥即得蚓激酶粗品；

(2)蚓激酶的纯化：

将步骤(1)提取的蚓激酶粗品用缓冲液溶解后，上离子交换柱，用磷酸盐缓冲液平衡，用0.1-0.6M氯化钠梯度洗脱，用HPLC分析，并用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测，收集具有纤溶活性的组分，冷冻干燥浓缩；

(3)蚓激酶组分F-III-2的分离及纯化：

将经离子交换得到的蚓激酶，过Superdex 75凝胶过滤色谱柱，用磷酸盐缓冲液洗脱，流速为1.0-1.3ml/h，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测纤溶活性，收集具有纤溶活性的第二个洗脱峰，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量为23500-27500Da，即为蚓激酶组分F-III-2纯品，洗脱峰经透析脱盐低温冷冻干燥备用；

(4)蚓激酶组分F-III-2分子修饰

a、将PEG活化成单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺脂肪

采用改良N-羟基琥珀酰亚胺活化脂法活化mPEG5000，即将mPEG5000，N-羟基琥珀酰亚胺溶于CH₂Cl₂中，完全溶解后搅拌约25-35min，缓慢滴加无水三乙胺，搅拌12h，向反应液中滴加乙醚，过滤后重新溶解于CH₂Cl₂中，然后再以乙醚沉淀，过滤，干燥，得到颜色为淡黄色的产物，即为单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺脂肪，以SC-mPEG表示；

称上述终产物于三口烧瓶中，加入氨基磺酸(NH₂SO₃H)，溶解于CH₂Cl₂中，缓慢滴加三乙胺与CH₂Cl₂混合液，继续反应5-7h，在低温下向反应物中缓慢加入乙醚，过滤后溶解于CH₂Cl₂，再以乙醚沉淀，所得产物即为活化的SC-mPEG，存放于真空干燥器中备用；

b、SC-mPEG修饰F-III-2

将活化过的修饰剂SC-mPEG与蚓激酶组分F-III-2以摩尔比1∶3的比例加入0.1mol/L，pH9.2的硼酸缓冲液中，在37℃下水浴保温1h，然后在0.1mol/L，pH7.0磷酸缓冲液中透析24h，然后用截流分子量为10000WM的超滤膜超滤，浓缩液冷冻干燥48h，即得经单甲氧基聚乙二醇甲酸琥珀酰亚胺脂肪修饰的蚓激酶，用SC-mPEG→F-III-2表示；

c、右旋糖苷修饰SC-mPEG→F-III-2

①右旋糖苷的活化

取右旋糖苷溶于蒸馏水，另取适量的NaIO₄，两溶液混合，在4℃冰箱反应18h、滴加5％的NaHSO₃的溶液还原过量的NaIO₄，室温下以蒸馏水透析4h后，再以适量的磷酸盐缓冲液透析16h，浓缩、冷冻干燥即得活化的右旋糖苷；

②活化右旋糖苷化学修饰SC-mPEG→F-III-2

用pH8.4，0.1M的硼酸缓冲液溶解SC-mPEG→F-III-2，按照1∶1摩尔比加入活化的右旋糖苷，在25℃下反应18h，滴加NaBH₄中止反应，再调pH值至7.0，对水透析4小时，冷冻干燥得修饰的蚓激酶，用SC-mPEG→F-III-2←糖苷表示。