[发明专利]一种低免疫原性蚓激酶及其制备方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及蚓激酶的制备方法，特别是涉及一种低免疫原性蚓激酶的制备方法和由其制备的可供口服、注射的多种剂型的药物制剂。属于生物制药领域。

背景技术

血栓和心脑血管疾病是一种严重威胁人类健康的重大疾病，特别是50岁以上中老年人健康的常见病，全世界每年死于血栓和心脑血管疾病的人数高达2500万人，居各种死因之首。血栓和心脑血管疾病已成为导致人类死亡的头号杀手。血栓和心脑血管疾病具有“四高一多”的特点，即“发病率高、致残率高、死亡率高、复发率高，并发症多”，目前，我国血栓和心脑血管疾病患者已经超过3.7亿人，我国每年死于血栓和心脑血管疾病的人达530万人，占我国每年总死亡人数的60％。而幸存下来的患者中75％患不同程度的并发症。因此，快速渗透，溶解血栓淤阻，使血管畅通，静脉曲张逐渐回落是治疗血栓和心脑血管疾病的关键。迄今为止人们已从多种生物组织中提取得到各种各样的溶栓酶，如链激酶、尿激酶、蝮蛇抗栓酶等并已开发成溶血栓类药物。这些药物在临床使用上，易引起出血、过敏等副作用；有的品种给药方式单一，使得用药范围受到很大限制；而有的原料非常缺乏，从而导致药价非常昂贵。

理想的溶栓药物要求可迅速溶解血栓、无毒、无出血等副作用，给药方便，价格便宜。因此寻找有效的治疗药物是国内外医学界重点攻关的热点之一。鉴于蚯蚓蚓激酶能溶解血栓，无毒副作用，且来源丰富、疗效显著，因此，人们期望能将蚯蚓蚓激酶开发成一种新型的溶栓药剂。

九十年代初，日本、韩国及我国的江西江中制药厂、山东青岛双龙药业有限公司等制药企业相继开发成功价格廉、疗效佳的口服蚓激酶胶囊，如博洛克，该产品为多组分酶制剂，经临床验证该酶可降低血液粘滞度、改善微循环。对缺血性心脑血管病、陈旧性血栓病、高血压、动脉硬化、心肌梗塞等具有较好治疗作用，尤其对因脑血管病导致的肢体瘫痪及语言障碍的恢复效果显著。但是，口服剂型在体内易受酶、抑制剂等分解破坏，也不易进入病灶细胞和组织，人体生物利用度低，吸收慢，起效时间长而无法作急救之用，此外蚓激酶对人体而言属于异种蛋白，即使纯度达到要求，也可能会在采用非肠胃道给药途径(如注射、输液等)进入人体后，使人体产生免疫过敏反应，使药物失去临床疗效，甚至会危及生命。所以蚓激酶的抗原性问题是影响注射用蚓激酶在体内发挥其功效的重要问题。此外，酶类药物在人体内的稳定性(半衰期)，抗水解酶降解能力等等也是影响酶在体内发挥其功效的因素。

本发明的目的是利用现代生物分离技术，分离得到来源广泛且具有较高纯度的蚓激酶(F-III-2组分)、通过大分子修饰剂聚乙二醇及右旋糖苷对其进行修饰，获得既可降底或消除蚓激酶的免疫原性，又可保留其生物活性，防止降解和延长半衰期的工艺方法；同时研制新剂型抗血栓生物药物-高纯度注射用蚓激酶。此外经分子修饰的低分子蚓激酶亦可用于抗血栓的固体制剂及液体制剂中，如：片剂，胶囊剂，口服液等。

发明内容

本发明的目的在于克服蚓激酶组分多，质量不易控制，易产生过敏反应，利用度低等不足，提供一种经分子修饰的低免疫原性蚓激酶的制备方法及由该方法制备得到的低免疫活性的蚓激酶，该方法的特点是制备得到的蚓激酶比活力≥30000IU/mg，分子量为25500±2000道尔顿，免疫原性较天然酶的免疫原性小，小于天然酶免疫原性的12％。

本发明的另一个目的是提供以低免疫活性蚓激酶为原料制成的片剂、硬胶囊剂、软胶囊剂、注射剂等多种途径给药的药物制剂。

为了达到所述的目的，本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种制备低免疫原性蚓激酶的方法，其特征在于包括首先从蚯蚓中提取得到蚓激酶粗品，然后粗品通过离子交换柱进行洗脱，纯化，收集具有纤溶活性的组分，冷冻干燥浓缩，浓缩后的蚓激酶溶液用凝胶过滤色谱柱进行分离，用琼脂糖-纤维蛋白平板法检测纤溶活性，收集具有纤溶活性的第二个洗脱峰，经SDS-PAGE电泳检测，其分子量为23500-27500Da，洗脱峰经透析脱盐低温冷冻干燥后采用活化的单甲氧基聚乙二醇以及右旋糖酐对其进行分子修饰，即得。

本发明的方法具体的，包括以下步骤：

(1)蚓激酶粗品的制备：