[发明专利]一种预防鸡疾病的疫苗及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种禽疫苗，尤其是涉及一种鸡疾病的疫苗及其制备方法。 

背景技术

长期以来，鸡群由于群居，容易爆发疾病，特别是传染性疾病，比如鸡传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病。鸡群常见的传染性疾病对养殖的影响非常大，如果不预防，将给养殖户带来巨大的经济损失。所以传染性疾病的预防性疫苗就凸现出了重要性。目前还没有特别有针对性的预防传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。 

另外菌种的分离方法多种多样，根据菌的不同来源和其本身的特点分离方法也各不相同，正确的分离培养有助于很快得到可疑的致病菌，对疫病的诊断是至关重要的。 

发明内容

本发明要解决的技术问题是：提供一种预防传染性支气管炎、肝炎病菌引起的疾病的疫苗。 

为实现上述目的，本发明提供一种鸡病原黄杆菌菌株，属黄杆菌科，学名为：鸡黄杆菌001 Flavobacterium sp.001，保藏号为CCTCC NO: M 2012100，于 2012年4月8日保藏于湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学保藏中心，即中国典型培养物保藏中心（CCTCC）。 

为得到本发明所述的鸡病原黄杆菌菌株，本发明还提供了一种分离方法，其步骤为： 

菌种的分离：

取发生传染性肝炎的病鸡肝部组织一小块（约50mg）放于装有300ul 1% TritonX-100的EP管中，用研磨棒研碎后，各取100ul于分别含有氨苄，卡纳和氯霉素的LB平板涂布，37℃培养24h；结果只有在含有氨苄和卡纳的平板上有菌落生长；

菌种扩大培养：

从上述长菌的平板中挑单菌落到抗生素的250ml LB液体培养基中，37℃摇床培养24-30小时，测OD600约为2.0；其抗生素为同时含有氨苄和卡纳；

菌种鉴定:

取上述扩大培养的菌液测序，得出所测的菌种是黄杆菌；具体为取上述扩大培养的菌液30ul送上海英俊生物技术有限公司测序，测序引物为16s引物，其序列为27F：AGAGTTTGATCCTGGCTCA（SEQ ID NO:1）；1492R：GGTTACCTTGTTACGACTT（SEQ ID NO:2）；将测序所得序列在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi）上比对，或者将所得序列翻译为蛋白序列后在NCBI（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/BlastAlign.cgi）上比对，最后得出所测的菌种是黄杆菌；

菌种的保存：

将上述扩大培养所得菌液进行20%甘油保菌法-80度保藏即可。即将灭菌后的甘油20ul中加80ul的菌液，充分混匀后即可。

本发明还提供了一种鸡病原黄杆菌菌株的疫苗，可以是灭活疫苗。 

本发明所述疫苗的制备方法是： 

接种：将权利要求1所述鸡病原黄杆菌菌株用灭菌生理盐水稀释后注射接种7日龄易感雏鸡；取病鸡肝部组织一小块放于装有1% TritonX-100的EP管中，用研磨棒研碎，制成生产用菌种；

灭活病菌液：将上述制成的生产用菌种中加入甲醛溶液，边加边充分摇匀，置摇床灭活，作为制苗用抗原液；

乳化制备疫苗：油相：注射用花生油占10%，水相：淀粉占2%和87ml的PBS混合后灭菌，之后将灭菌的吐温-80加到水相之中，占1%，将上述佐剂加上同样体积的制苗用抗原液后进行乳化，充分振摇使吐温完全溶解；在乳化终止前加入防腐剂；防腐剂为1％硫柳汞，加入量占疫苗总体积的1％，最终浓度为万分之一；

分装：将乳化得到的疫苗分装于灭菌疫苗瓶内，密封，4℃保存即可。

制备方法还包括检测是否完全灭活的步骤。在确保完全灭活病菌的同时尽量减少甲醛使用量，对病菌抗原液在不同甲醛灭活终浓度(0.1％、0.2％、0.3％和0.4％)及灭活时间(3h、6h、12h 、24h和48h)进行了多次交叉重复实验。研究结果表明：甲醛终浓度为0.4％，灭活时间为48h，灭活效果最佳。检测是否完全灭活的方法可为取灭活的菌液于同时含有氨苄和卡纳的LB平板涂布，37℃培养72小时，平板上是否长菌；同时取灭活菌液于同时含有氨苄和卡纳的LB液体培养基中，37℃培养72小时，液体培养基是否长菌；以上两点均没有长菌，则说明菌液已经完全灭活。 

本发明还提供按照上述制备方法制备所得的疫苗。