[发明专利]一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法及其专用引物

权利要求书

1.一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的专用引物，其特征在于：鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph-429f：5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’；Sph-933r：5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。

2.一种权利要求1所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，其特征在于：将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板，挑取黄色菌落反复划线分纯，经液体培养后，提取纯菌株基因组DNA，采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌；

鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph-429f：5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’；Sph-933r：5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。

3.按权利要求2所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，其特征在于：

1)制备样品土壤微生物细胞悬液：称取5g待测土样加入45mL生理盐水并添加玻璃珠，于150rpm振荡2h；而后将悬浮液静置，取上清液，用生理盐水对土壤悬液进行10倍梯度稀释；

2)涂布链霉素抗性LB固体平板：取0.1ml步骤1)中稀释度为10^-2-10^-6的土壤悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上，以30℃倒置培养4天；

3)划线分纯：挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落，在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯，直至分离出单菌落；

4)提取纯菌株基因组DNA：将步骤3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基，30℃摇床过夜培养；而后采用试剂SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl提取基因组DNA；

5)属特异性引物扩增纯菌株16SrDNA片段：以Sph-429f和Sph-933r作为鞘氨醇单胞菌属16SrDNA特异性引物，模板为步骤4)中提取的基因组DNA进行PCR扩增，PCR反应产物用1.5％琼脂糖凝胶电泳检测，得到阳性PCR产物且片段大小为504bp的菌株，即为鞘氨醇单胞菌；

Sph-429f：5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’；Sph-933r：5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。

4.按权利要求3所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，其特征在于：所述步骤5)PCR扩增PCR反应体系组成如下：1μlDNA模板，10×PCR反应缓冲液5μl，2.5mmol/LdNTP混合溶液4μl，20pmol/L引物Sph-429f1μl，20pmol/L引物Sph-933r1μl，Taq酶(5U/μl)0.25μl，加灭菌去离子水至总体积为50μl；PCR反应条件：94℃预变性5min，94℃变性1min，55℃退火45s，72℃延伸90s，35个循环，最后72℃延伸8min。

5.按权利要求3所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，其特征在于：所述步骤4)提取纯菌株基因组DNA：将3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基，30℃150rpm摇床过夜培养，8000rpm离心2min收集菌体，加入597μlTE缓冲液重悬菌体，并加入30μl10％的SDS和3μl20mgml^-1的蛋白酶K于37℃温浴1h；然后加入100μl5moll^-1NaCl和80μl10％CTAB/NaCl混匀，65℃温浴10min；水浴后加入800μl的酚-氯仿-异戊醇混合液混合均匀，6000×g离心10min收集上清，上清液中再加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液混合均匀，6000×g离心10min收集上清；上清液中再加入上清液0.8倍体积的异丙醇室温静置1h，12000×g离心20min离心收集DNA沉淀。