[发明专利]一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法及其专用引物

说明书

技术领域

本发明涉及微生物学技术和分子生物学技术交叉领域，具体的说一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法。

背景技术

鞘氨醇单胞菌从属于α-变形菌纲，鞘氨醇单胞菌目，鞘氨醇单胞菌科，由于其具有某些生理特征(如含大质粒、可降解多环芳烃类化合物、产生黄色素等)以前曾被归于假单胞菌属(Pseudomoans)或黄杆菌属(Flavobacterium)。1990年，日本学者Yabuuchi等通过研究16SrRNA的核苷酸序列、胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q的主要类型，首次提出这是一个新的细菌属——鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。该属的菌株均为革兰氏阴性菌，无孢子，以单侧生极性鞭毛运动，多呈黄色，专性需氧且能产生过氧化氢酶。其细胞膜组成不同于一般的革兰氏阴性好氧菌特有的脂多糖，而是糖鞘脂，这是所有鞘氨醇单胞菌都具有的重要特征。

近年来，大量的鞘氨醇单胞菌已经陆续从环境中被分离出来，而且大多数是从多氯联苯、杂酚油、五氯苯酚、除草剂、多环芳烃(PAHs)等污染环境中发现的。这些分离自污染环境的鞘氨醇单胞菌几乎都具有降解污染物的能力，表明鞘氨醇单胞菌是一类具有代谢多样性的微生物资源，暗示了其在生物修复方面的潜在重要性。此外，由于其能够耐受极端贫营养条件，并产生有价值的高分子聚合物，该属逐渐成为环境微生物领域关注的一个热点研究对象。

目前，还没有一种选择性培养基能够针对鞘氨醇单胞菌进行专一培养，因此目前所获得的可培养鞘氨醇单胞菌资源大多是通过从环境样品中分离某种特定功能菌株，然后经生理生化特性鉴定，确认其为鞘氨醇单胞菌，这使得鞘氨醇单胞菌的发现和分离具有偶然性和随机性，大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。目前，还没有一种能够从环境样品中特异性快速直接分离可培养鞘氨醇单胞菌的方法。

目前，国内尚未有其他学者以16SrDNA为研究对象，针对鞘氨醇单胞菌这一特定种属进行研究。国外有少数报道曾尝试设计鞘氨醇单胞菌16S rDNA属特异性引物或探针，包括简并引物或非简并引物，但所设计的引物检测特异性差，即除了能扩增鞘氨醇单胞菌外，还能扩增其它属的菌株；或检测谱小，不能扩增绝大多数的鞘氨醇单胞菌属菌株。因此，目前还没有一对合适的非简并引物能够特异性扩增鞘氨醇单胞菌16SrDNA。

发明内容

本发明目的在于提供一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法。

为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的专用引物，鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph-429f：5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’；Sph-933r5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。

一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法，将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板，挑取黄色菌落反复划线分纯，经液体培养后，提取纯菌株基因组DNA，采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段，存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌；

鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCRph-429f和Sph-933r为Sph-429f：5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’；Sph-933r：5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。

具体为：

1)制备土壤样品微生物细胞悬液：称取5g待测土样加入45mL生理盐水并添加玻璃珠，于150rpm振荡2h；而后将悬浮液静置，取上清液，用生理盐水对土壤悬液进行10倍梯度稀释；

2)涂布链霉素抗性LB固体平板：取0.1ml步骤1)中稀释度为10^-2-10^-6的土壤悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上，以30℃倒置培养4天；

3)划线分纯：挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落，在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯，直至分离出单菌落；

4)提取纯菌株基因组DNA：将步骤3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基，30℃摇床过夜培养；而后采用试剂SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl提取基因组DNA；