[发明专利]透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

权利要求书

1.一种一步法检测透明质酸(HA)的化学发光试剂盒，其特征在于试剂盒包括：1)HA校准品2)HA包被板3)HA酶结合物4)化学发光底物液A和化学发光底物液B。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的HA包被板上包被有与牛血清白蛋白(BSA)偶联的HA(HA-BSA)。

3.如权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于所述的HA-BSA按照如下方法制备：准确称取5mg HA抗原，溶解于2ml 0.1mol/L pH 5.6磷酸盐缓冲液(PB)加10mg牛血清白蛋白，溶解后加5mg 1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)-碳二亚胺(EDC)4℃反应17-20小时，装入透析袋于1000ml 0.01mol/L pH7.4PB中透析，换液4次，取出冻存于-15℃以下备用。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的HA酶结合物是由透明质酸结合蛋白(HABP)和辣根过氧化物酶(HRP)标记的HABP抗体分别按体积比1∶2000和1∶6500稀释到酶稀释液中(含50mmol/L PB，0.25％BSA，10％丙三醇)，经过4℃20小时二者充分反应后配制而成。

5.如权利要求4所述的试剂盒，其特征在于其中HABP的制备方法如下：取新鲜牛鼻软骨，洗净后切成小块，加入4mol/L盐酸胍，制成均浆，4℃提取30小时，抽提液13000g离心1小时，上清液对水透析，冷冻干燥后即得HABP粗品，HABP粗品1.6g，溶于25ml 0.1mol/L Tris-HCl(pH 7.3)中，加入5mg胰蛋白酶，于37℃温育2小时，加入1mg大豆胰蛋白酶拟制因子，在上述HABP粗品酶解液中，加入38g盐酸胍，用0.5mol/L醋酸-醋酸钠缓冲液补足体积至50ml，与亲和层析凝胶混合，置于透析袋中，对蒸馏水透析，4℃过夜，透析后将凝胶装柱，依次用1mol/L和3mol/L的氯化钠(NaCl)梯度洗脱未吸附物及杂蛋白，然后用4mol/L盐酸胍洗脱，分步收集洗脱液，各组份分别取少量与碘标记HA(¹²⁵I-HA)反应，合并与¹²⁵I-HA有结合的组份，对水透析后，用PEG 20000进行浓缩成3mg/ml，冻存于-15℃以下保存。

6.如权利要求4或5所述的试剂盒，其特征在于其中HABP抗体的制备方法如下：采用常规免疫法将HABP按照0.5mg/kg的免疫剂量融合完全佐剂多点注射到大耳白实验用兔子的背部皮下，间隔15天后相同方法、相同免疫剂量注射HABP融合的不完全佐剂，共免疫5次，颈动脉取血，分离出血清，测定血清滴度，硫酸铵2次分级沉淀得到兔IgG，透析于2000ml 50mmol/L pH7.4PB缓冲液中过夜，透析4次后取出，冻存于-15℃以下备用。

7.如权利要求4，5或6所述的试剂盒，其特征在于其中酶标记HABP抗体的制备方法如下：采用改良高碘酸钠氧化法将HABP抗体与辣根过氧化物酶(HRP)联结：称取5mg HRP溶解于1ml蒸馏水中，加入0.2ml新配的0.1mol/L高碘酸钠(NaIO₄)溶液，室温下避光搅拌20分钟。将上述溶液装入透析袋中，对1mmol/L pH4.4的醋酸钠缓冲液透析，4℃过夜。加20μl 0.2mol/L pH9.5碳酸盐缓冲液，使以上醛化HRP的pH升高到9.0～9.5，然后立即加入10mg HABP抗体在1ml 0.01M碳酸盐缓冲液中，室温避光轻轻搅拌2小时，加0.1ml新配的4mg/ml硼氢化钠(NaBH₄)液，混匀，再置4℃2小时，将上述液装入透析袋中，对0.15mol/L pH7.4PB透析，4℃过夜。

8.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述的化学发光底物液A的制备方法为：6mmol/L过氧化氢，50mmol/L pH7.1Tri s-HCL缓冲液；化学发光底物液B的制备方法为：4mmol/L Luminol，1.2mmol/L p-iodophenol，50mmol/L pH8.6Tris-HCl缓冲液。