[发明专利]透明质酸一步法化学发光定量检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及一种一步法进行人血清、体液或组织匀浆中透明质酸(Hyaluronic Acid，简称HA)含量检测的化学发光试剂盒。属于免疫分析医学范畴。

背景技术

近年来的临床医学陆续发现透明质酸含量变化与肿瘤的生长、浸润和扩散密切相关，尤其发现检测血清HA对诊断肿瘤有一定价值，可作为区分良、恶性肿瘤的一个重要指标。它还有助于肝病的诊断和鉴别诊断、病情判断和预后评估，还是抗纤维化药物治疗的一个非常重要的动态观察手段。

目前，HA的检测方法主要以放射免疫方法为主，文献CN1047391A公开了一种放射免疫方法检测透明质酸(H A)含量的方法。它将碘标记的HA(¹²⁵I-HA)与未知量标本中的H A共同竞争加入的透明质酸结合蛋白(HABP)，再用第一抗体、第二抗体将结合复合物沉淀下来，测其放射性计数，通过标准品的浓度-计数关系计算出拟合方程，根据样本放射性计数反推出其中的HA含量来。这是一种比较灵敏、准确的透明质酸检测方法。但是上述方法也存在一定的缺陷：一、加样步骤繁琐。整个实验包括三步加样和离心等过程，反应的总计时间达到2个多小时；二、试剂盒操作自动化程度低，试剂盒的有效期也很短。只有30-45天；三、使用¹²⁵I作为标记物，对环境产生放射性污染，对操作人员健康有潜在危害。

同样，在市场上也有一部分的HA化学放光和酶联检测试剂，据了解，它们大多数都是采用三步法反应模式，免疫反应的时间一般都要1.5-2个小时左右，可以说操作起来都比较繁琐。究其原因在于这些试剂盒都借助了HA与HABP之间的结合反应，而HABP是一个成分和结构比较复杂的蛋白，提纯工艺复杂，纯度也不会太高，且其与HA的结合力没有像抗原和抗体的结合力那么强，所以，一、不能用它直接包被，干扰因素比较多，造成试剂的重复性差。二、不能用它直接标记，HABP某些活性基团极易失活，造成试剂的稳定性差。

本发明从根本上解决了透明质酸试剂盒不能一步法检测的难题，可以让操作更方便，让检测更准确。其反应原理为：预先在固相载体(例如96孔微孔板)上包被HA，再依次加入校准品或样品和HA酶结合物，反应过程中固相包被HA与样本中的HA共同与限量的HABP-anti-HABP-HRP进行竞争性结合反应，经过一定的反应温度和反应时间，经洗涤除去某些游离成分，最终在固相板上形成HABP-anti-HABP-HRP的复合物。校准品或样本中的HA含量越高，在包被板上形成的复合物就越少。测定时，先洗去包被板中的液体，再加入发光底物液A和B，发光底物液中的化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化，形成一个激发态的中间体，当这种激发态中间体回到稳定的基态时，会释放等能级的光子，对光子进行测定从而实现定量分析。

本试剂盒的突出技术优势具体在于：

(1)采用化学发光定量测定方法，充实了透明质酸的免疫检测手段，进一步突出了方法学具有的灵敏度高，特异性强，精密度好，线性范围宽，试剂稳定性好等优点。本发明试剂盒所有组分从缓冲液到原材料再到制备条件均经过了最优化筛选与配比，大大提高了试剂盒的的灵敏度，特异性，检测范围和准确性。试剂盒的底物系统使用鲁米诺(Luminol)/过氧化氢/辣根过氧化物酶(HRP)/对碘苯酚(p-iodophenol)底物发光系统，其在精心配比的Tris-HCL缓冲液中延长了底物系统发光持续时间，1小时内对样品的测定值变化在10％以内，大大提高了测定结果的稳定性。

同时，本试剂盒适用于开放式化学发光检测仪器，更有利于其进一步推广和应用。

(2)液体试剂可直接使用，无需提前配制；可拆卸板条最大满足实验设计要求。

(3)一步法反应，操作极为简单，只需向微孔中连续加入校准品或样本及HA酶结合物，反应1小时即可。

(4)间接法形成酶结合物，从根本上解决辣根过氧化物酶直接标记HABP存在的不稳定、易失活的问题，试剂盒的稳定性大大改善，有效期可以达到6个月，而且测定结果的重复性也明显提高。

(5)采用LogX-(1-B/B₀)拟合方法进行数据处理，避免个别低值血样发光值偏出标准曲线范围，无法计算的弊病。

本试剂盒在具备了灵敏度高，测值准确，重复性好，试剂稳定，有效期长，等技术优势的基础上，科学性、创新性地解决了HA酶促法(化学发光和酶联法)试剂普遍存在的技术难题，大大简化了操作步骤，令其独特品质在国内的HA非放试剂中名列前茅。

发明内容