[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体及其应用

权利要求书

1.一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，其特征在于：载体为大肠杆菌-枯草芽孢杆菌穿梭表达载体，其上装载有免疫球蛋白结合蛋白功能域编码基因。

2.权利要求1所述的重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及部分编码序列；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

(c)将测序正确的CotB片段双酶切后连接到相同双酶切的pDG1662上，得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)全序列合成链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，得到质粒pUC57-C；

(b)PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列；

(c)将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序；

(d)将测序正确的A功能域片段双酶切后连接到相同双酶切的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，双酶切得到片段AC后连接到相同双酶切的步骤(1)得到的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。

3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于：具体步骤如下：

(1)调取载体蛋白基因：

(a)PCR方法扩增枯草芽胞杆菌的CotB基因调控序列及部分编码序列：

上游引物B1序列为：5’GAATTCgaatccgagtttcgcaagtcct3’；

下游引物B2序列为：5’AAGCTTggatgattgatcatctgaagattt3’；

位置：两端酶切位点分别为EcoR I、HindIII；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、53℃30Sec、75℃1min循环扩增30次；

(b)将上述PCR扩增产物连接pMD-18T载体，测序正确后分别用EcoR I和HindIII双酶切，电泳回收目的片段后，依次连接到用相同双酶切的质粒pDG1662上，转换大肠杆菌DH5α，涂氨苄青霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB；

(2)调取目的基因及构建载体：

(a)全序列合成链球菌G蛋白C1功能域于载体pUC57上，两端分别加入Xho I、EcoR I酶切位点，得到质粒pUC57-C；

(b)PCR方法扩增金黄色葡萄球菌A蛋白A功能域序列：

上游引物As序列为：5′-AAGCTTggtgaagctcaaaaacttaatgact3′；

下游引Aa序列为：5′-CTCGAGtaaaacgttagtgctttggctt3′；

位置：两端酶切位点分别为HindIII、Xho I；

扩增条件是：95℃4min，经95℃30Sec、52℃30Sec、72℃1min循环扩增30次；

(c)将上述PCR扩增产物连接到pMD-18T载体上，测序正确后双酶切连接到步骤(a)得到的质粒pUC57-C上，得到质粒pUC57-AC，测序正确后用HindIII和BamH I双酶切，电泳回收目的片段后，连接到用相同双酶切的质粒pDG1662-CotB上，得到质粒pDG1662-CotB-AC，转换大肠杆菌DH5α，涂氯霉素抗性平板选择阳性克隆，并用菌液PCR及双酶切鉴定，从而得到质粒pDG1662-CotB-AC，即为重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体。