[发明专利]一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体及其应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种重组枯草芽孢杆菌免疫球蛋白结合蛋白功能域表达载体，其宿主细胞，及其制备方法与应用，属于生物技术领域。 

背景技术

疫苗是控制由病原引起的疾病的重要环节，机体大部分的感染发生在粘膜或由粘膜入侵机体致病，因此，粘膜途径是接种疫苗的一个良好选择。痢疾菌苗经滴鼻途径免疫小鼠能有效地激发鼻粘膜局部分泌抗原特异性IgA、IgG的升高，同时诱发远离免疫诱导部位的胃肠粘膜和生殖道粘膜分泌抗原特异性IgA、IgG升高，并诱发血清中抗原特异性IgA、IgG升高，表明共同粘膜免疫系统的存在，同时说明鼻粘膜是一个敏感有效、简便安全的免疫途径。 

与其他佐剂相比细菌载体疫苗表现了众多优点：1.模仿自然感染途径，能够保证大部分粘膜表面区域接触疫苗，开发由sIgA介导的第一道防线；2.可以通过口服和鼻饲接种，方法简便易行；3.细菌能使大量的树突状细胞(Dendritic cells，DC)聚集，具有免疫佐剂的作用，不仅可以刺激机体的粘膜免疫而且可以刺激机体的全身免疫；4.诱导作用位点比较明确，安全可靠。菌体佐剂也有众多研究报道[1]。与营养型菌体比较，芽孢具有自己独特的优势：1.芽孢表达体系稳定，能抵抗多种不良因素的影响；2.芽孢被用做人及动物的食物添加剂和多种胃肠道病症的处方药及非处方药的成分，因此安全性好；3.当前已有芽孢为基础的商业化产品，生产工艺成熟；4.大部分枯草芽孢杆菌芽孢衣蛋白，包括CotA，CotB，CotC，CotD，CotF无显著的功能，缺乏其中任何一个都不会引起明显的性状改变[2]，因此有希望应用以上多个融合载体蛋白建立多价疫苗。Duc等[3]对枯草芽孢杆菌芽孢的免疫特性以及在细胞内的归宿研究显示：芽孢可诱导机体产生局部免疫和系统免疫反应，该课题组以CotB-TTFc重组芽孢口服、鼻腔免疫小鼠能产生特异性抗体。对口服免疫小鼠的抗体类型分析显示，主要为IgG、IgA和IgM，其中IgG包括IgG1、IgG2a、IgG2b和IG3亚型，口服免疫后54d IgG1和IgG2b亚型水平最高；而鼻腔免疫后抗体主要为IgG1、IgG2b和IgM，口服免疫后的小鼠可抵抗致死剂量破伤风毒素攻击。Mauriello等[4]用CotC为融合表达载体蛋白展示了TTFC及LT，用其粘膜免疫小鼠也诱导了全身及粘膜特异性抗体，充分说明枯草芽孢杆菌芽孢是粘膜免疫的一个有效载体，并能成功的在其表面展示不同的抗原蛋白。并且有研究显示，芽孢表面展示抗原比芽孢萌时展示的抗原诱导能力更加有效[5]。目前活菌疫苗载体的研究主要集中与在菌体表面展示抗原的细菌展示技术，一种细菌载体一般只展示一种抗原，因此，应用免 疫球蛋白结合蛋白(immunoglobulin(Ig)-bindingproteins，BPs)与IgG Fc段结合的特性建立一种具有递呈多种蛋白抗原能力的通用型菌体免疫佐剂对促进粘膜途径疫苗的发展具有重要作用。因此本发明将葡萄球菌A蛋白(SPA)A结构域和链球菌G蛋白C1结构域融合表达展示在芽孢表面构建新型通用的粘膜免疫佐剂，将蛋白抗原结合到芽孢表面可用于接种方法中。 

1.Osorio M，Wu Y，Singh S，et al.Anthrax protective antigen delivered by Salmonella enterica serovar Typhi Ty21a protects mice from a lethal anthrax spore challenge.Infect Immun.2009，29. 

2.Adriano O H，Charles P M.Structure and assemblyof the bacterial endospore coat.Methods.2000，20(1)：95-110. 

3.Due L H，Hong H A，Uyen N Q，et al.Intracellular fate and immunogenicity of B.subtilis spores.Vaccine.2004，22(15-16)：1873-1885. 

4.Mauriello E M，Duc le H，Isticato R，et al.Display of heterologous antigens on the Bacillus subtilis spore coat using CotC as a fusion partner.Vaccine.2004，22(9-10)：1177-1187.