[发明专利]一种灵菌红素高产菌株及其生产方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种灵菌红素高产菌株及其生产方法。 

背景技术

灵菌红素族（Prodigiosins）是一类具有甲氧基吡咯环结构的天然红色素的总称，可由多种放线菌和细菌产生。包括灵菌红素（Prodigiosin）及其相似物和衍生物，如Prodigiosin25-C，metacyclo Prodigiosin，Prodigiosen，cycloProdigiosin，desmethoxy prodigiosin和undecyl prodigiosin等。灵菌红素及其衍生物能用于纺织品的染色、杀灭引起赤潮和水华的藻类，还具有抗细菌、抗真菌、抗疟疾、抗肿瘤、免疫抑制等多种生物活性。目前人们最感兴趣的是此物质所具有的免疫抑制活性和引起的肿瘤细胞凋亡作用。如2007年美国Gemin X制药公司开发的灵菌红素类抗癌专利药物GX15-070已经进入临床II期研究，该小分子药物有望成为新型诱导凋亡的药物。灵菌红素类似物或衍生物在医药工业中有广泛的应用前景，正成为抗肿瘤、免疫抑制类药物研究的热点。 

20世纪60年代，Rapoport等建立了Prodigiosin化学合成的全过程，1996年Alessio等提出了新的制备方法，但由于合成过程复杂、成本高，大规模化学合成Prodigiosin一直未能实施。研究人员围绕灵菌红素的微生物代谢展开了一系列的研究。尽管灵菌红素具有多种生物活性，但是其体内细胞毒性和药理活性仍然缺乏有效数据。目前制约灵菌红素进一步开发利用的是缺少适合工业化生产的灵菌红素高产菌株和制备方法。已发现的产灵菌红素微生物大多存在发酵时间长（主发酵时间2-3 d），产量较低（大多低于3 g/L）、色素产生不稳定等原因。使得后续的化学修饰、药物制剂、药理活性等研究存在瓶颈。Wei等通过改进培养基，并添加脯氨酸作为前体物质，使十一烷基灵菌红素(undecyl prodigiosin)产量可达到2.5 g/L。Cang等从土壤中获得了一株以乙醇为唯一碳源的沙雷氏菌，灵菌红素产量达2.95 g/L。Giri等在摇瓶培养基中添加花生粉，灵菌红素达到目前报道的最高产量38.75 g/L，但是并没有对提取物中灵菌红素的纯度进行说明。 

作为灵菌红素的生产菌株，必须有稳定的色素合成能力。我们曾经采用LiCL/DES结合紫外线育种的方法进一步提高灵菌红素的产量。但是经多轮筛选的高产菌株，经过10代以上的培养，发现其色素合成能力不稳定或下降。灵菌红素合成的稳定性也是筛选灵菌红素高产工业微生物的关键。 

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供从焦化废水中筛选灵菌红素高产菌株Serratia marcescens ZL3的方法，以及使用该菌株生产高纯度灵菌红素的方法。菌株Serratia marcescens ZL3在30-40 h的培养时间内，灵菌红素的产量可以达到6-8 g/L。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一种灵菌红素高产菌株，名称为粘质沙雷氏菌（Serratia marcescens） zl3，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2012096，保藏日期为2012年4月4日，保藏地点为中国.武汉.武汉大学。

本发明灵菌红素高产菌株的生产方法包括如下步骤： 

（1）取5 mL污水接种于45 mL含苯酚富集培养基中，30℃、130 r/min培养72 h。取经过驯化的菌液各1mL涂布在含苯酚的无机盐培养基平板上30℃培养72 h，苯酚终浓度分别为100 mg/L, 300 mg/L, 500 mg/L, 700 mg/L, 1000 mg/L。挑取生长情况良好的菌落在富集培养基平板上划线分离，30℃培养72 h ，在含苯酚1000 mg/L的无机盐培养基上进一步培养筛选能产生红色素的菌落；

所述富集培养基的组分为(g/L)：胰蛋白胨 10、酵母浸出物 5、NaCl 7.5、苯酚100 mg 、pH 7. 0；

所述无机盐培养基的组分为(g/L):硝酸铵1、磷酸二氢钠 0. 5、磷酸氢二钾 0. 5、硫酸镁 0.2、氯化钙 0.1、氯化钠0.2、pH 7.0；

相应的固体培养基加入2%的琼脂粉，含苯酚培养基则加入适量苯酚。

（2）在富集培养基上培养24～72 h观察划线平板，菌落由起初的淡红色逐渐变为鲜红色，表面光滑 ，粘稠状。