[发明专利]发夹型核酸荧光探针及其在检测铅离子的应用

权利要求书

1.一种发夹型核酸荧光探针，其特征在于：该发夹型核酸荧光探针的序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。

2.权利要求1所述的发夹型核酸荧光探针在检测铅离子中的用途。

3.按照权利要求2所述的发夹型核酸荧光探针在检测铅离子中的用途，其特征在于使用方法如下：

(1)配制发夹型核酸探针储备液

取33μg序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’探针，加入pH为7.0、物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液35μL，配制成物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针储备液，置于-20℃冰箱中，备用；

(2)退火发夹型核酸探针溶液

取1.0×10^-4mol/L的发夹型核酸探针溶液2μL，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液稀释至1.0×10^-6mol/L作为探针母液，在水浴锅中加热到90℃，保持5分钟进行热处理，冷却至室温，放于4℃冰箱中过夜；

(3)配制待测样品溶液

a.打开水管放水20分钟，量取自来水100mL，煮沸5分钟去除氯，备用；

b.37℃，用1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液将离体的人血清稀释100倍；

(4)测定样品

a.配制铅离子标准溶液：按常规方法分别配制物质的量浓度为1.0×10^-4mol/L、1.0×10^-5mol/L、1.0×10^-6mol/L、1.0×10^-7mol/L的铅离子标准溶液；

b.制作标准曲线：取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液98μL，取步骤(2)中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，配制成探针最终浓度为2×10^-8mol/L的混合溶液，室温静置15分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F₀；在上述的混合溶液中逐级加入0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-7mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-6mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.5μL浓度为1.0×10^-5mol/L、0.4μL浓度为1.0×10^-4mol/L的铅离子标准溶液，得到最终铅离子标准溶液的物质的量浓度为5×10^-10mol/L、1×10^-9mol/L、5×10^-9mol/L、1×10^-8mol/L、5×10^-8mol/L、1×10^-7mol/L和5×10^-7mol/L，室温静置5分钟，用荧光分光光度计检测溶液的荧光强度F，荧光分光光度计的激发波长为480nm、发射波长为520nm、激发波长和发射波长狭缝宽度均为10nm、负高压为700V，以lg浓度为5×10^-10～5×10^-7mol/L铅离子溶液为横坐标X，1-F/F₀为纵坐标Y，由origin 7.5软件作图，得到标准曲线的线性回归方程：

Y＝0.2005X+1.8984

线性相关系数为0.9969。

c.检测样品溶液中的铅离子：取物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液48μL和步骤(2)中1×10^-6mol/L的探针母液2μL，加入50μL水样，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测水样的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收；

将步骤(2)中1×10^-6mol/L的探针母液2μL和1μL离体的人血清加入到97μL物质的量浓度为1.0×10^-2mol/L pH值为7.0的三羟甲基氨基甲烷-醋酸缓冲溶液中，混合均匀，静置15分钟，用荧光分光光度计检测血清的荧光强度，采用标准加入法进行铅离子的回收，按下式计算铅离子的回收率：

R％＝m_测/m_实

式中m_测是待测样品中铅的质量，m_实是标准样品中铅的质量。