[发明专利]发夹型核酸荧光探针及其在检测铅离子的应用

说明书

技术领域

本发明属于分析检测技术领域，具体涉及基于发夹核酸荧光探针构型的转变检测铅离子。

背景技术

重金属原义是指比重大于5的金属，包括金、银、铜、铁、铅等，重金属在人体中累积达到一定程度，会造成慢性中毒。对环境污染和人体毒害最大的有5种：铅、汞、铬、砷、镉。这些重金属在水中不能被分解，人饮用后毒性放大，与水中的其他毒素结合生成毒性更大的有机物或无机物。铅，是重金属污染中毒性较大的一种，一但进入人体很难排除。直接伤害人的脑细胞，特别是胎儿的神经板，可造成先天大脑沟回浅，智力低下；对老年人造成痴呆、脑死亡等。英国科学家研究表明，铅可以缩短人的寿命，如果人类饮食铅的含量为零，那么人的寿命将过140岁。因此，铅离子的快速灵敏检测对人类健康和环境监测都有着十分重要的意义。

传统的检测铅离子的方法有原子吸收光谱法、电感耦合等离子体法等，都可以有效地检测铅离子，但这些方法需要大型仪器，操作复杂，样品的使用量大，无法进行痕量检测，因此限制了其广泛的应用。

近几十年来发展的检测铅离子的方法有比色法、电化学分析法、荧光分析法，这种方法灵敏度低，重现性差，一般很少采用；电化学分析法，虽然灵敏度较高，但耗时耗力，选择性差，不利于快速检测样品；荧光分析法，灵敏度高，选择性好，时间短，可以进行痕量检测，因此得到广泛应用。

检测铅离子的荧光核酸探针越来越多，像8-17核酸酶，由H.Wang，Y.Kim，H.P.Liu，Z.Zhu，S.Bamrungsap and W.H.Tan，Engineering a Unimolecular DNA-Catalytic Probe for Single Lead Ion Monitoring，J.Am.Chem.Soc.，2009，131(23)，8221-8226公开；纳米粒子由F.Chai，C.Wang，T.Wang，L.Li，and Z.Su，Colorimetric Detection of Pb²⁺Using Glutathione Functionalized Gold Nanoparticles，ACS Appl.Mater.Interfaces，2010，2(5)，1466-1470公开；G4核酸酶由T.Li，S.Dong and E.Wang，A Lead(II)-Driven DNA Molecular Device for Turn-On Fluorescence Detection of Lead(II)Ion with High Selectivity and Sensitivity.J.Am.Chem.Soc.，2010，132(38)，13156-13157公开。其中分子信标作为发夹结构的荧光核酸探针，是一种极好的生物分子传感器。分子信标技术具有极高的特异性，而且操作简便、灵敏度高，特别是它可以进行实时定量检测、甚至可以用于活体分析在临床诊断、基因检测等领域，分子信标也越来越显示出它的优势。但是一般的分子信标是双标记的核酸探针，造成其成本高，应用受限。

发明内容

本发明所要解决的一个技术问题在于克服已有技术的缺点，提供一种识别性能好、特异性高、选择性好、灵敏高的发夹型核酸荧光探针。

本发明所要解决的另一个技术问题在于为发夹型核酸荧光探针提供一种新用途。

解决上述技术问题所采用的技术方案是：发夹型核酸荧光探针的序列为5’-FAM-CGTCATGGGTGGGTGGGTGGGTGACGGGG-3’。

上述发夹型核酸荧光探针的合成方法由下述步骤组成：

脱保护：将预先连接在固相载体控制微孔玻璃上的活性基团被保护的核苷酸与12.1gmL三氯乙酸反应，脱去其5′-羟基的保护基团二甲氧基三苯甲基，获得游离的5′-羟基。

缩合：合成DNA的原料-单体，与2.9mL活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3′端被活化，5′-羟基仍然被二甲氧基三苯甲基保护，与溶液中游离的5′-羟基发生缩合反应。

带帽反应：用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应。

氧化：在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为磷酸三酯。

通过上述步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被连接上去。合成过程中可以观察三氯乙酸处理阶段的颜色判定合成效率。

氨解：通过氨水55℃处理，连接在控制微孔玻璃上的引物被切下来。