[发明专利]一种病毒通用PCR检测方法

权利要求书

1.一种病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：其包括以下步骤

1） 样品处理

将样品用0.2-0.25um滤器过滤，滤液经30-30K超滤管5000rpm离心20-30分钟，浓缩至1-2ml，余液洗涤滤管内滤膜几次后收集浓缩液，合并后得到浓缩病毒液，浓缩病毒液中分别加入2-5μl的DNase 2-5μl的RNase及5-10μl10× Buffer，37℃消化1.5小时后，80℃5min终止消化；

2）提取核酸

消化好的病毒液，用总核酸试剂盒分别提取病毒DNA和RNA；

3）扩增处理

取病毒DNA或RNA提取液5-10μl，2-52ul 5-10μM的随机引物，加入到反应体系中，离心混匀后，进行扩增处理；

4）电泳观测：

取上述扩增处理后的样品5-10μl，用含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1%w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，

5）扩增产物克隆

将电泳观测结果为阳性的扩增产物纯化回收，回收产物连接于T载体，加入到连接体系中，于10-16℃过夜连接；连接产物加入至50-100μl的DH5α感受态中，冰浴30min后，于40-42℃水浴热激80-90s，置冰上3～5min后，加入300-500μl的LB培养基，37℃振荡培养1h，将培养液于2000-3000rpm离心3min，弃去培养基，剩余培养基重新与样品处理中过滤后沉淀混合，混合液涂布于AMP⁺ LB固体培基，充分吸收后，于37℃倒置培养12～16h；取5-10个克隆，分别于AMP+LB培养基培养3～6小时，试剂盒提取质粒后，于37℃对质粒进行双酶切1-2h；

6）基因组测序分析

取上述克双酶切后的样品5-10μl，与2-6μl 的0.25%w/v溴酚蓝上缓冲液混合，在含有0.5-1.0μg/ml溴化锭的0.8-1%w/v琼脂糖凝胶，经过10-20min电泳和显色，在投射紫外灯下观察酶切结果阳性的样品进行进行测序。

2.根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于细胞，前处理步骤为取细胞5-10×10⁶个，液氮中或-80℃温度下反复冻融三次于10000-12000rpm离心5-10min，取上清为样品，开始1）样品处理步骤；或者，所述前处理步骤为将细胞进行单层培养，细胞长满培养瓶后，用胰蛋白酶消化细胞，细胞从培养瓶表面脱落后，收集细胞液，液氮或-80℃中反复冻融三次，12000rpm离心10min，取上清为样品，开始1）样品处理步骤。

3.根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于动植物组织，前处理步骤为取组织样品100-200mg在液氮中研磨至匀浆，匀浆液在液氮中或-80℃温度下反复冻融三次，10000-12000rpm离心10min，取上清为样，品开始1）样品处理步骤。

4.根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于全血，前处理步骤为将全血于37℃溶解，加入3-5倍全血体积于红细胞裂解液，10000-12000rpm离心10min，吸取中间白膜层为样品，开始1）样品处理步骤。

5.根据权利要求1所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：其还包括样品前处理步骤，所述样品来源于血清或血浆，前处理步骤为直接将血清或血浆于37℃溶解得样品，开始1）样品处理步骤。

6.根据权利要求1-5所述的病毒通用的PCR检测方法，其特征在于：所述3）步骤中，取DNA提取液时，采用一次PCR扩增，即将5-10μlDNA提取液，2-52ul5-10μM的随机引物，加入PCR反应体系中，ddH₂O补足50μl，离心混匀后，通过94-95℃解链2min；然后94-95℃变性30-40s；退火复性30℃ 2min ，33℃，20s；36℃，20s；39℃，20s；42℃，20s；45℃，20s；48℃，20s；51℃，20s；54℃，20s， 再72℃延伸2min，经过30-35个循环，最后72℃延伸5-10min；4℃冷却保存10min，得到扩增样品。